寡核苷酸的同步检测及其相关的试剂盒和用途制造技术

一方面，本发明专利技术涉及一种用于从一个生物样品中平行地检测至少两个等长的不同寡核苷酸的方法，所述方法包括如下步骤：提供含有或疑似含有所述目标寡核苷酸的生物样品；使用至少两个具有不同表面电荷的经荧光标记的检测分子形成杂交混合物；利用阴离子交换HPLC分离与所述寡核苷酸杂交的所述检测分子；以及通过定量荧光读数检测杂交的检测分子‑寡核苷酸部分。在又一个方面，本发明专利技术涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含如在本发明专利技术中定义的至少两个检测分子。在另一个方面，本发明专利技术涉及使用至少两个具有不同表面电荷的检测分子从一个生物样品中平行地定量检测至少两个等长的不同寡核苷酸的用途。

Synchronous detection of oligonucleotides and their related kits and uses

On the one hand, the invention relates to a method for parallel detection of at least two different oligonucleotide length from a biological sample, the method comprises the following steps: providing or containing the biological samples suspected of containing the target oligonucleotide; use at least two different surface charge by the detection of fluorescently labeled molecules formed hybrid mixture; molecular detection using anion exchange separation with the HPLC oligonucleotide hybridization of the quantitative fluorescence detection; and through reading hybridization molecular detection part oligonucleotide. In another aspect, the present invention relates to a kit containing at least two detection molecules defined in the invention. In another aspect, the invention relates to the use of at least two detection molecules with different surface charges to detect two oligonucleotides at least equal lengths from a biological sample.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】寡核苷酸的同步检测及其相关的试剂盒和用途DNA和RNA分子在多种生物体的基因表达中具有重要作用。例如，最近发现小RNA作为转录后基因表达(特别是基因沉默)的重要调节因子影响活细胞的生理和病理过程。从那时起，已发现多种短RNA是在植物、动物和DNA病毒中类型丰富的基因调节物，并且已在从裂殖酵母到人的多种生物体中鉴定了不同来源和功能的短RNA。其中，miRNA是在植物和动物中丰度最高的小调控性RNA类型。到目前为止，已通过克隆和测序鉴定了超过20000种不同的miRNA(参见例如miRBase：在http://www.mirbase.org/的microRNA注册数据库，桑格研究所，英国)。在通常情况下，miRNA的特征在于具有21-25个核苷酸(nt)的长度并且通过在miRNA与其靶mRNA之间形成互补碱基对的机制参与蛋白表达的调控。该过程导致蛋白翻译的抑制，并且，取决于miRNA与其靶位点之间序列互补的程度，其还可导致mRNA转录物的降解(综述参见例如BartelDP,Cell2009,136(2):215-233)。已发现恶性肿瘤和肿瘤细胞系与正常组织相比显示出失调的miRNA表达谱，根据这样的发现，认为miRNA表达的改变参与了一些人类疾病，特别是癌症(综述参见例如Farazi等，2013,Adv.Exp.Med.Biol774:1-20)。也就是说，在人类癌症中已经观察到miRNA水平的全面降低，表明小调控性RNA在肿瘤抑制中可能具有固有功能。由于在肿瘤中存在miRNA的全面下调，因而miRNA的表达谱可能反映出这种疾病的来源和分化状态。以类似的方式，其他疾病的特征为内源性表达的miRNA水平的上调和/或下调，例如小调控性RNAmiRNA-21，已发现其在几乎全部类型的癌症中表达失调，但是也发现其在包括发育、心血管和肺脏疾病以及炎症在内的多种其他生物过程中发挥着重要作用(综述参见例如Kumarswamy等，2011,RNABiology8:5,706-713，和Kataoka和Wang,Cell2014,3:883-898)。此外，已发现肾衰竭的特征为具有不同的小调控性RNAmiRNA-320和miR-210的表达模式(LorenzenJ.M.等，Clin.J.Am.Soc.Nephrol,6:1540-1546)。合成的分子能够以高度序列特异性与选定的靶基因序列结合，这在医学和生物
非常重要，因为其为基因治疗剂和诊断装置的发展带来了希望。也就是说，例如已知序列的寡核苷酸常用于各种各样的化学和生物应用中，并且其在诊断和治疗应用中越来越重要。在生理样品中分析作为治疗剂使用的寡核苷酸(包括以例如miRNA表达谱的形式对小调控性RNA的分析)已经发展成为医学诊断中的一种重要工具。MicroRNA是易于检测的寡核苷酸，目前已将其作为多种疾病的生物标记物。因此，用于定量分析特定类别的小调控性寡核苷酸的高灵敏度检测系统是先进医学诊断的重要工具。然而，目前的高通量检测方法在很大程度上依赖于使用定量实时聚合酶链反应(RT-PCR)的方法。RT-PCR使得能够以绝对拷贝数形式和相对数量形式进行检测和定量。然而，这些方法需要进行包括靶序列的预扩增在内的大量的样品制备，并且其耗时又昂贵。目前主要将离子交换色谱结合UV吸收或荧光检测，用于分析合成寡核苷酸的纯度或者用于检测寡核苷酸的修饰。在此处，在正电固定相上根据磷酸二酯骨架上负电荷的数量来分离寡核苷酸，而负电荷的数量取决于寡核苷酸骨架的长度。与UV检测或荧光读数偶联的离子交换色谱还在治疗性寡核苷酸的药代动力学分析中被描述(WO2010/043512A1，综述参见例如Batkai和Thum,2014,JournalofChromatographyB,964:146-152)。不断发展的小调控性寡核苷酸领域目前在分子水平以及大规模诊断水平上面临许多分析方面的改变。因此，在高通量筛选的情况下，提供灵敏度高、可靠和迅速的用于绝对定量和归一化的检测方法是医学研究、诊断和治疗领域中最重要的主要问题。因此，会一直需要一种改进方法，用于从一个样品中平行地定量检测数个目标寡核苷酸，包括分析长度相等但具有不同种类的小调控性RNA的表达模式，或其他治疗性寡核苷酸。在本专利技术的情境下，已发现能够对具有不同序列但是长度相等的数个寡核苷酸进行定量检测，从而平行地进行分析，可以使用互补的检测分子与阴离子交换高效液相色谱(AEX-HPLC)的方法相结合，其中检测分子用荧光标记和化学修饰以具有不同的总表面电荷。也就是说，等长的寡核苷酸具有相似的骨架负电荷，因此与带正电荷的固相结合后会显示出相似的洗脱性质，但是，与带有不同表面电荷的互补检测分子的退火显著改变了目标寡核苷酸的总表面电荷，从而能够改善分辨率并能够分离以其他方式不可能分离的各目标寡核苷酸，因为各目标寡核苷酸在与各自的检测分子杂交后发生了结合亲和性的改变。因此，本专利技术的方法特别适于在一个样品中平行地检测一种以上的寡核苷酸，特别是当这些寡核苷酸具有相同或相似的长度时，采用色谱方法对其进行分离通常具有挑战或存在障碍。因此，本专利技术的方法特别适于在一项方法中检测多个等长的小调控性RNA或DNA分子，包括例如在从一个目标生物样品中平行地对多个miRNA或小治疗性RNA进行高通量定量的情境下。因此，在第一个方面，本专利技术涉及一种用于从一个生物样品中平行地定量检测至少两个等长的不同寡核苷酸的方法，所述方法包括步骤：a)提供含有或疑似含有所述至少两个等长的不同寡核苷酸的生物样品；b)通过将生物样品与至少两个检测分子接触形成杂交混合物，所述至少两个检测分子同所述至少两个等长的不同寡核苷酸互补，其中所述检测分子各自经至少一个荧光部分标记，并且其中所述检测分子具有不同的表面电荷；c)利用阴离子交换高效液相色谱(AEX-HPLC)将与所述至少两个等长的不同寡核苷酸杂交的检测分子与非杂交的检测分子部分分离；d)通过定量荧光读数检测杂交的检测分子-寡核苷酸部分。如在本专利技术情境下所使用的，术语“寡核苷酸”通常指由脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)组成的寡聚物或多聚物，优选指由核糖核苷酸(RNA)组成的寡聚物或多聚物。因此，在本专利技术的情境下，目标寡核苷酸优选是RNA寡核苷酸形式的RNA分子，其包括但不限于小调控性RNA如miRNA和siRNA。同样优选的是，本专利技术的寡核苷酸是DNA寡核苷酸形式的DNA分子，包括但不限于各种各样的合成设计和/或合成生产的DNA寡核苷酸，如举例来说诱饵寡核苷酸。原则上，本专利技术的寡核苷酸包括各种各样的由核碱基(即含氮碱基)、五碳糖(其可以是核糖、2’-脱氧核糖或其任意衍生物)和磷酸基团组成的结构。核碱基和糖构成了称为核苷的单元。磷酸基团可以与2、3或5位的碳形成键，特别是与糖的3位和5位碳。核糖核苷酸含有核糖作为糖部分，而脱氧核糖核苷酸含有脱氧核糖作为糖部分。核苷酸可以含有嘌呤或嘧啶碱基。因此，由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或由其任意组合构成的本专利技术的寡核苷酸还可以包含一个或多个经修饰的核苷酸。任选地，寡核苷酸还可以仅包含经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的核糖和脱氧核糖形式例如可以包括但不限于5-丙炔基-尿苷、5-丙炔基-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从一个生物样品中平行地定量检测至少两个等长的不同寡核苷酸的方法，所述方法包括步骤：a)提供含有或疑似含有所述至少两个等长的不同寡核苷酸的生物样品；b)通过将所述生物样品与至少两个检测分子接触形成杂交混合物，所述至少两个检测分子同所述至少两个等长的不同寡核苷酸互补，其中所述检测分子各自经至少一个荧光部分标记，并且所述检测分子具有不同的表面电荷；c)利用阴离子交换高效液相色谱(AEX‑HPLC)将与所述至少两个等长的不同寡核苷酸杂交的所述检测分子与非杂交的检测分子部分分离；d)通过定量荧光读数检测所述杂交的检测分子‑寡核苷酸部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.02 EP 15000588.21.一种用于从一个生物样品中平行地定量检测至少两个等长的不同寡核苷酸的方法，所述方法包括步骤：a)提供含有或疑似含有所述至少两个等长的不同寡核苷酸的生物样品；b)通过将所述生物样品与至少两个检测分子接触形成杂交混合物，所述至少两个检测分子同所述至少两个等长的不同寡核苷酸互补，其中所述检测分子各自经至少一个荧光部分标记，并且所述检测分子具有不同的表面电荷；c)利用阴离子交换高效液相色谱(AEX-HPLC)将与所述至少两个等长的不同寡核苷酸杂交的所述检测分子与非杂交的检测分子部分分离；d)通过定量荧光读数检测所述杂交的检测分子-寡核苷酸部分。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个不同的寡核苷酸具有从10个至50个核苷酸，优选地从12个至40个核苷酸，更优选地从18个至30个核苷酸的长度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少两个等长的不同寡核苷酸选自下组：miRNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短活化RNA(saRNA)、诱饵寡核苷酸、反义寡核苷酸、适体(aptamer)和镜像异构体(spiegelmer)。4.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所述检测分子选自下组：肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)和ugimer。5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中所述检测分子具有从10个至30个核苷酸，优选地从10个至20个核苷酸，更优选地从15个至20个核苷酸的长度。6.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中所述至少两个检测分子各自经具有相同种类的荧光部分标记。7.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其中所述至少两个检测分子的不同表面电荷选自下组：中性、...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·劳尔，N·多夫勒，J·尼斯，
申请(专利权)人：AXO实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE