用于同时检测样品中多个核酸序列的方法技术

本发明专利技术属于检测样品中的核酸序列例如检测临床样品中的病原生物的技术领域。更具体地，本发明专利技术涉及通过扩增和检测来自所述病原生物的特异性核酸序列来检测由临床标本中病原生物如病毒或细菌引起的感染的领域。它提供了可以在单个单管测定中结合实时探针检测来确定约30个不同靶核酸序列的多重测定。

A method for simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample

The present invention belongs to the technical field of detecting nucleic acid sequences in samples, such as detection of pathogenic organisms in clinical samples. More specifically, the present invention relates to the detection of the infection caused by pathogenic organisms, such as viruses or bacteria in clinical specimens, by amplifying and detecting the specific nucleic acid sequences from the pathogenic organisms. It provides a multiple determination of about 30 different target nucleic acid sequences in single single tube determination with real-time probe detection.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于同时检测样品中多个核酸序列的方法专利
本专利技术涉及检测样品中的核酸序列例如检测临床样品中的病原生物的
更具体地，本专利技术涉及通过扩增和检测来自所述病原生物的特异性核酸序列来检测由临床标本中病原生物如病毒或细菌引起的感染的领域。专利技术背景通常通过在有利于这样的生物生长的条件下培养临床样品并通过包括显微镜的许多不同技术监测生长和检测生物的或多或少的特异性代谢物，来检测传染性病原体。在过去十年中，已经在微生物实验室中实施了核酸扩增测试，以迅速可靠地鉴定病原体。核酸扩增测试可用于直接在临床标本中检测微生物的存在而无需培养。最初，通过扩增靶核酸序列并通过使用凝胶电泳和DNA结合荧光染料的可视化检测所得到的DNA来实现鉴定。核酸扩增测试彻底改变了临床诊断世界，因为与传统培养测定相比，它们提高了几个数量级的灵敏度和速度。通常，核酸扩增测试由靶特异性核酸扩增步骤和或多或少的通用检测步骤组成。本文下面是可用的扩增技术和检测平台的简要概述。PCR目前仍然是扩增靶序列的第一选择，扩增各种病原体的能力取决于通用、随机或多重扩增技术。在通用PCR测试中，从一系列相关病原体扩增靶序列只需要一个或两个引物对即可。需要保守核苷酸序列的区域，并且通常使用简并引物对。存在几种随机扩增技术，其使用随机八聚体或在其3'端含有随机的5-8个核苷酸延伸并且在其5'端具有规定的序列的引物。随机扩增与Taq聚合酶或基于等温聚合酶的扩增酶如KlenowDNA聚合酶或Φ29DNA聚合酶组合进行。多重PCR涉及在一个扩增反应中靶向不同序列的若干引物对的组合。多重PCR需要仔细优化，以使其作为单对扩增反应具有可比较的灵敏度和特异性。多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术(Schoutenetal；WO01/61033,Schoutenetal.,Nucl.AcidsRes.2002,vol30No12；e57)是能够同时扩增不同靶的多重PCR方法。在MLPA中，在相同的反应中加入两个在靶DNA上彼此紧邻相互杂交的寡核苷酸。寡核苷酸中的一个是合成的，并且具有40-60个核苷酸(nt)的大小，而另一个寡核苷酸具有100至400nt的大小，并且需要在M13载体中的克隆步骤以最终产生单链探针DNA。MLPA由三个步骤组成：第一是将探针杂交到其靶区域的退火步骤，第二是将两个探针共价连接在一起的连接步骤，第三是最终PCR，以仅使用两个通用引物获得靶区域的指数扩增。目前，靶特异性多重PCR扩增是病原体检测测定的标准方法。由于核酸扩增测试的极端灵敏性，必须注意避免这些试验中的污染。所扩增核酸的检测最初通过使用凝胶电泳和嵌入DNA染料的大小测定进行。当扩增和检测步骤组合成一个步骤时，采取了最小化污染的第一步。结果，消除了扩增后处理步骤，从而增加了测定的可靠性。此类测定通常被称为封闭系统。已经开发了封闭系统扩增技术如实时PCR(Ratcliffetal.CurrIssuesMolBiol.2007,9(2):87-102)和NASBA(Loensetal.,JClinMicrobiol.2006,44(4)；1241–1244)和LAMP(SaitoRetal.,JMedMicrobiol.2005,54；1037-41)，并使用嵌入荧光染料或荧光标记的探针。等温LAMP技术允许通过使用实时浊度计的分光光度分析实时检测。目前，这些测定中的大多数是生物特异性的，仅在怀疑特定病原体时才有用。这大大限制了这些测定的范围。然而，临床症状很少归因于单一病原体。因此，本领域需要允许同时鉴定和区分多个病原体的测定。这种多参数测定使临床医生能够进行更快更好的治疗，并有助于临床管理和公共卫生的改善。为此，已经开发了用于同时测试多于一个生物的技术。这些技术之一是多重实时PCR。然而，目前只有五种彩色寡探针多重检测是可能的，其中一种颜色原则上预留用于内部对照以监测抑制，甚至可以充当共同扩增的竞争者(Molenkampetal.J.VirolMethods,2007,141:205-211)。这大大限制了同时测试的病原体的数量。呼吸道感染的区域是特别希望对于几种病原体立即进行快速、可靠和特异性多重测定的区域的例子。急性呼吸道感染是成人和儿童中最普遍的急性感染类型。涉及的病原体数量众多。呼吸道感染(RTI)通常分为上呼吸道感染(URTI)和下呼吸道感染(LRTI)。URTI包括鼻漏，结膜炎，咽炎，中耳炎和鼻窦炎，而LRTI包括肺炎，毛细支气管炎和支气管炎。病毒和细菌二者都会引起急性RTI，而病原体的数量大并且是多样的。涉及RTI的非典型病毒和细菌包括甲型流感病毒和乙型流感病毒(InfA和B)，副流感病毒1、2、3和4(PIV-1、-2、-3和4)，呼吸道合胞病毒A和B(RSVA和B)，鼻病毒，冠状病毒229E，OC43和NL63(Cor-229E、-OC43和NL63)，严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)，人偏肺病毒(hMPV)，腺病毒，肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)，肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)，嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)和百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)。这些感染中的许多仅在临床特征上是无法区分的，并且需要快速的实验室测试来优化患者管理和感染控制。病毒培养仍然是呼吸道病毒实验室诊断的金标准。然而，病毒培养相对较慢，因此常规诊断是次优的。尽管对这些病毒中的一些病毒有可用的快速抗原检测测试，但是这些测试已经显示出比病毒培养更不灵敏和更不具有特异性。目前，迫切需要以多重形式同时检测呼吸道病毒的灵敏和特异性的方法。在单个反应中能够检测两个或更多个靶是非常有利的，因为这将在临床诊断中提供明显的优点。它将简化测定，增加通量，最大限度地减少临床标本的消耗，并且特别是多重测定比单一(monoplex)测定更具成本效益。为了区别检测临床标本中的呼吸道病毒，以下检测平台已被使用：(i)凝胶电泳。使用琼脂糖凝胶电泳作为检测装置，已经开发了使用三或四个引物对的几种嵌套多重逆转录酶(RT)-PCR测定。Osiowy等人(J.Clin.Microbiol.1998,36；3149-3154)使用5个引物对，其从呼吸道合胞病毒A和B，副流感病毒1、2和3以及1型至7型的腺病毒扩增RNA。PCR产物的大小从84个至348个碱基对变化。与直接免疫荧光(DIF)测定或间接免疫荧光(IIF)测定相比，该多重RT-PCR方法获得了91％的灵敏度值和87％的特异性值。Coiras等人(J.Med.Virology,2004,72；484-495)使用相同的方法，能够在两个多重RT嵌套PCR测定中同时检测14个呼吸道病毒。它们包括冠状病毒229E和OC43，鼻病毒，肠病毒，副流感病毒4和内部对照，但忽略了腺病毒1至7。该测定评估了两岁以下婴儿的鼻和喉咙拭子(swap)和鼻咽抽吸物。似乎该多重测定比常规病毒培养和免疫荧光测定更灵敏，其优点是可以在同一时间和用单个技术测试所有病毒。另外，在9.5％的样品中发现双重感染。Erdman等人(J.Clin.Microbiol.2003,41；4298-4303)最近开本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测和区分临床样品中的多个病源生物的方法，临床样品包含衍生自多个病源生物的多个不同靶RNA模板和/或多个不同靶DNA模板，每个靶DNA模板包含第一靶区段和第二靶区段，第一靶区段和第二靶区段二者的组合对于特定靶DNA模板是特异性的，其中第一靶区段和第二靶区段基本上彼此相邻并且其中第一靶区段位于所述第二靶区段的3'，所述方法包括以下步骤：(a)多个不同靶RNA模板逆转录为多个不同靶DNA模板的逆转录步骤和多个不同靶DNA模板的预扩增步骤；(b)使所述多个不同靶DNA模板与多个不同探针组接触，每个探针组对于多个不同靶DNA模板中的特定靶DNA模板或其互补物是特异性的，并允许特定靶DNA模板与其杂交，每个探针组包括：具有可与所述特定靶DNA模板的第一靶区段杂交的第一靶区域和第一标签区域的第一核酸探针，其中所述第一标签区域包含第一标签序列，以及具有可与所述特定靶DNA模板的第二靶区段的互补物杂交的第二靶区域和第二标签区域的第二核酸探针，其中所述第二标签区域包含第二标签序列，并且其中所述第一核酸探针或所述第二核酸探针中的至少一个含有位于靶与第一或第二标签序列之间的检测序列；和其中每个标签区域位于相应靶区域的5'(c)形成多个连接的探针组件，其中所述多个连接的探针组件包含多个不同探针组，并且通过将每个探针组的所述第一核酸探针与其相应的靶DNA模板链杂交和将每个探针组的所述第二核酸探针与其相应的反向靶DNA模板链杂交而形成；(d)扩增多个连接的探针组件以获得多个扩增子，其中通过允许多个连接的探针组件与多个核酸引物对接触来扩增多个连接的探针组件，每个核酸引物对包含：引物1和引物2，其中引物1或引物2中的至少一个在其3'端或其3'端附近包含至少一个内部供体或受体荧光标记，从而在所述多个连接的探针组件扩增后提供多个内部标记的扩增子，其中所述内部供体或受体荧光标记被并入所述第一或第二标签区域中，并且基本上与所述检测序列相邻；和(e)在单个反应容器中检测和区分所述多个内部标记的扩增子，其中通过进行实时解链曲线分析来检测和区分所述多个内部标记的扩增子，所述实时解链曲线分析包括：(1)提供多个标记的检测探针，每个标记的检测探针对于特定内部标记的扩增子的特定检测序列是特异性的，并且包含：与通过所述多个核酸引物对并入第一或第二标签区域中的内部供体或受体荧光标记互补的至少一个荧光供体或受体标记，其中使用单对供体和受体标记来检测多个内部标记的扩增子，其中每个类似标记的检测探针在与特定内部标记的扩增子的特定检测序列杂交后显示不同解链温度，使得所述多个内部标记的扩增子是可区分的；和可与特定内部标记的扩增子的所述特定检测序列特异性杂交的核酸区域，(2)允许所述多个内部标记的扩增子与所述多个标记的检测探针杂交，和(3)通过测量在不同荧光检测通道内预先选择的增加的温度范围内受体标记的荧光来监测所述多个标记的检测探针的杂交和不同解链温度，其中：所述多个标记的检测探针的杂交指示临床样品中多个不同病源生物的存在，不同解链温度与多个标记的检测探针的不同荧光标记的组合允许检测和能够区分临床样品中的多个不同病源生物，从而可以检测和区分临床样品中的至多约30种不同病源生物。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.23 US 14/694,0081.用于检测和区分临床样品中的多个病源生物的方法，临床样品包含衍生自多个病源生物的多个不同靶RNA模板和/或多个不同靶DNA模板，每个靶DNA模板包含第一靶区段和第二靶区段，第一靶区段和第二靶区段二者的组合对于特定靶DNA模板是特异性的，其中第一靶区段和第二靶区段基本上彼此相邻并且其中第一靶区段位于所述第二靶区段的3'，所述方法包括以下步骤：(a)多个不同靶RNA模板逆转录为多个不同靶DNA模板的逆转录步骤和多个不同靶DNA模板的预扩增步骤；(b)使所述多个不同靶DNA模板与多个不同探针组接触，每个探针组对于多个不同靶DNA模板中的特定靶DNA模板或其互补物是特异性的，并允许特定靶DNA模板与其杂交，每个探针组包括：具有可与所述特定靶DNA模板的第一靶区段杂交的第一靶区域和第一标签区域的第一核酸探针，其中所述第一标签区域包含第一标签序列，以及具有可与所述特定靶DNA模板的第二靶区段的互补物杂交的第二靶区域和第二标签区域的第二核酸探针，其中所述第二标签区域包含第二标签序列，并且其中所述第一核酸探针或所述第二核酸探针中的至少一个含有位于靶与第一或第二标签序列之间的检测序列；和其中每个标签区域位于相应靶区域的5'(c)形成多个连接的探针组件，其中所述多个连接的探针组件包含多个不同探针组，并且通过将每个探针组的所述第一核酸探针与其相应的靶DNA模板链杂交和将每个探针组的所述第二核酸探针与其相应的反向靶DNA模板链杂交而形成；(d)扩增多个连接的探针组件以获得多个扩增子，其中通过允许多个连接的探针组件与多个核酸引物对接触来扩增多个连接的探针组件，每个核酸引物对包含：引物1和引物2，其中引物1或引物2中的至少一个在其3'端或其3'端附近包含至少一个内部供体或受体荧光标记，从而在所述多个连接的探针组件扩增后提供多个内部标记的扩增子，其中所述内部供体或受体荧光标记被并入所述第一或第二标签区域中，并且基本上与所述检测序列相邻；和(e)在单个反应容器中检测和区分所述多个内部标记的扩增子，其中通过进行实时解链曲线分析来检测和区分所述多个内部标记的扩增子，所述实时解链曲线分析包括：(1)提供多个标记的检测探针，每个标记的检测探针对于特定内部标记的扩增子的特定检测序列是特异性的，并且包含：与通过所述多个核酸引物对并入第一或第二标签区域中的内部供体或受体荧光标记互补的至少一个荧光供体或受体标记，其中使用单对供体和受体标记来检测多个内部标记的扩增子，其中每个类似标记的检测探针在与特定内部标记的扩增子的特定检测序列杂交后显示不同解链温度，使得所述多个内部标记的扩增子是可区分的；和可与特定内部标记的扩增子的所述特定检测序列特异性杂交的核酸区域，(2)允许所述多个内部标记的扩增子与所述多个标记的检测探针杂交，和(3)通过测量在不同荧光检测通道内预先选择的增加的温度范围内受体标记的荧光来监测所述多个标记的检测探针的杂交和不同解链温度，其中：所述多个标记的检测探针的杂交指示临床样品中多个不同病源生物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·G·C·M·瑞珍斯，G·J·H·丁格曼斯，A·A·T·P·布林克，A·F·M·希蒙斯，
申请(专利权)人：病理取景器有限责任公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL