本发明专利技术提供了一种分泌抗赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株F‑3‑3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14303。此细胞株分泌的抗赭曲霉毒素单克隆抗体灵敏度高、特异性好、抗干扰性好，对赭曲霉毒素A的50％抑制浓度IC50为0.990μg/L，对中药中可能存在的真菌毒素、农药、重金属、炮制过程中使用的辅料及污染菌等均具有较好的抗干扰性，为中药中赭曲霉毒素A的免疫检测提供了条件，具有实际应用价值。
A hybridoma cell line secreting monoclonal antibodies against ochratoxin and its application
The invention provides a hybridoma cell line secreting monoclonal antibody against toxin ochratoxin F 3 3, has been preserved in bacterial China microbe preservation management committee, the preservation number is CGMCC No.14303. Anti ochratoxin monoclonal antibody secreted by high sensitivity and good specificity, good anti-interference of this cell line of ochratoxin A 50% inhibition concentration of IC50 was 0.990 g/L, which has a good anti-interference ability may exist in traditional Chinese medicine by mycotoxins, pesticides and heavy metals, in the course of processing and accessories the pollution of bacteria, provide conditions for immune medicine ochratoxin A detection, which has practical application value.
【技术实现步骤摘要】
一种分泌抗赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种分泌抗赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
中药材从生产、采收、加工、运输、贮藏等过程均有可能因自身性质与外界因素的影响而污染真菌，进而发生霉变并污染真菌毒素。霉变不仅会影响中药材的质量，使药材失去原有的药用价值，造成巨大的经济损失，而且在霉变过程中，产生的多种真菌毒素会对患者的肝、肾、神经和造血系统等造成严重的损害，甚至可能诱发癌症。同时，随着当今中医药保健养生观念的普及，越来越多“药食同源”的大宗中药材被用于人们日常的饮食和保健当中，市场的需求量大，若这些中药材受到真菌毒素的污染，则势必会危害更多的人群的健康，加重个人和医疗系统的经济负担，更有可能进一步影响社会的和谐和稳定。赭曲霉毒素(ochratoxin)是曲霉菌属和青霉菌属等产毒菌株产生的二级代谢产物，包括赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、赭曲霉毒素C(OTC)、赭曲霉毒素D(OTD)、OTA的甲酯以及OTB的甲酯和乙酯等7种结构类似的化合物，均为异香豆素联结L-苯丙氨酸的衍生物。赭曲霉毒素对农作物的污染在全球范围内都比较严重，其中以赭曲霉毒素A在自然界分布最广，污染水平最高，且毒性最强，不仅有致畸、致突变和致癌等作用，还具有免疫毒性、肝毒性和肾毒性，并被认为与巴尔干地方性肾病有关，因此与人类健康的关系最为密切。国际癌症研究机构(IARC)在1993年将其定为2B类致癌物。由于赭曲霉毒素的危害严重，引起了各国的普遍重视。OTA的含量通常很低，所以检测手段要求较高。目前，用于测定OTA的方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)等色谱法，其与质谱和核磁共振联用技术正逐渐被用于十分特殊的测定和确定多种真菌毒素。这些方法检测准确、检测限低，但需要复杂的样品前处理过程、专门的仪器以及专业的人员培训，在实际应用中受到了很大的限制。免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分泌抗赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株制备的单克隆抗体对OTA具有较好的特异性和较高的检测灵敏度，对中药中可能存在的真菌毒素、农药、重金属、炮制过程中使用的辅料及污染菌等均具有较好的抗干扰性，为建立中药中OTA的免疫学检测方法奠定基础。本专利技术的技术方案，一种分泌抗赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为赭曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株F-3-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14303，保藏日期为2017年06月15日。抗赭曲霉毒素单克隆抗体，其是由保藏编号为CGMCCNo.14303的赭曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株F-3-3分泌产生的，所述抗赭曲霉毒素单克隆抗体应用于中药中赭曲霉毒素A的分析检测。本专利技术提供F-3-3细胞株的基本制备过程：(1)OTA半抗原合成及鉴定：取8-羟基-3-甲基-1-氧代苯并吡喃-7-羧酸0.5g，加20mL二氯甲烷溶解，取草酰氯0.31g，加0.5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解稀释，滴加到二氯甲烷溶液中，室温搅拌2h，加入4-硝基苯丙氨酸0.52g，加三乙胺0.3mL，室温搅拌2h，停止反应，加水20mL，震荡静置，分出水相，有机相浓缩蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/石油醚(V/V，1/5)洗脱分离，得到硝基赭曲霉素0.87g；取硝基赭曲霉素0.87g，加乙醇50mL溶解，加钯碳0.2g，通入氢气，室温搅拌4h，停止反应，过滤，除去钯碳，旋蒸除去乙醇，得到红色油状物，在30mL二氯甲烷/石油醚(V/V，1/1)重结晶，得到氨基赭曲霉素0.76g，即为OTA半抗原，收率95％，核磁共振氢谱鉴定结果；(2)完全抗原合成：将OTA半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联得到免疫抗原(OTA-BSA)和包被抗原(OTA-OVA)；(3)动物免疫：取健康的6～8周雌性Balb/c小鼠10只(分为A与B两组，每组5只)，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下多点注射，每只小鼠免疫剂量为200μgOTA-BSA；之后加强免疫每两周颈背部皮下多点注射一次，乳化用弗氏不完全佐剂；最后一次免疫使用生理盐水代替弗氏不完全佐剂，采用腹腔注射，注射剂量和前面几次相同；通过间接ELISA检测血清效价；(4)细胞融合与细胞株筛选：加强免疫后第三天，通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过完全培养液培养，利用间接ELISA法检测分泌OTA的细胞株，利用间接竞争ELISA法测定该细胞株的抑制效果，筛选最好抑制的阳性细胞株进行三次亚克隆，最终获得杂交瘤细胞株F-3-3；(5)抗体制备纯化及特性鉴定：将液体石蜡注射6～8周Balb/c小鼠，500μL/只；10天后每只小鼠0.5mL杂交瘤细胞CGMCCNo.14303注射到腹腔，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，SDS-PAGE凝胶电泳法分析纯化效果，获得的单克隆抗体进行效价、亚型、交叉反应性测定，置于-20℃保存；(6)抗体的应用：将杂交瘤细胞株F-3-3分泌的抗赭曲霉毒素单克隆抗体用于制备赭曲霉毒素A酶联免疫试剂盒，以用于中药中赭曲霉毒素A的分析检测。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术提供的杂交瘤细胞株F-3-3可以用于制备高效价抗赭曲霉毒素单克隆抗体，抗赭曲霉毒素小鼠腹水抗体ELISA法测得的效价≥20000。(2)本专利技术提供的抗赭曲霉毒素单克隆抗体灵敏度高、特异性好、抗干扰性好，对赭曲霉毒素A的50％抑制浓度IC50为0.990μg/L，对中药中可能存在的真菌毒素、农药、重金属、炮制过程中使用的辅料及污染菌等均具有较好的抗干扰性。(3)本专利技术提供的抗赭曲霉毒素单克隆抗体可应用于测定中药中赭曲霉毒素A含量。生物材料样品保藏：一株分泌抗赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年06月15日，保藏编号为CGMCCNo.14303。附图说明图1赭曲霉毒素A半抗原合成路线图图2赭曲霉毒素A竞争ELISA标准曲线图图3赭曲霉毒素A竞争ELISALogit/Log标准曲线图具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1：杂交瘤细胞株F-3-3的筛选1.半抗原合成及鉴定OTA半抗原的合成路线如附图1所示。取8-羟基-3-甲基-1-氧代苯并吡喃-7-羧酸0.5g，加20mL二氯甲烷溶解，取草酰氯0.31g，加0.5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解稀释，滴加到二氯甲烷溶液中，室温搅拌2h，加入4-硝基苯丙氨酸0.52g，加三乙胺0.3mL，室温搅拌2h，停止反应，加水20mL，震荡静置，分出水相，有机相浓缩蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/石油醚(V/V，1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌抗赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为赭曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株F‑3‑3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14303，保藏日期为2017年06月15日。
【技术特征摘要】
1.一种分泌抗赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为赭曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株F-3-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14303，保藏日期为2017年06月15日。2.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，洪小栩，万宇平，崔廷婷，袁媛，曹东山，南铁贵，赵正苗，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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