一种H7禽流感病毒单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术属于临床免疫学技术领，具体公开了一种H7禽流感病毒单克隆抗体及应用，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞1H11分泌得到，该杂交瘤细胞已送至CCTCC保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017112。所述的单克隆抗体效价高，特异性好，并且具有阻断效果，可用于制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒，利用该试剂盒对待检样品进行测试，与HI试验有98%以上的符合率，相对HI试验，缩短了试验时间，操作步骤更简单。

【技术实现步骤摘要】
一种H7禽流感病毒单克隆抗体及应用
本专利技术是属于临床免疫学
，涉及H7禽流感病毒的检测与鉴定
，具体涉及一种H7禽流感病毒单克隆抗体，还涉及一种分泌H7禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，同时还涉及一种H7禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，还涉及H7禽流感病毒单克隆抗体在制备检测H7禽流感病毒试剂盒中的应用。
技术介绍
禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，具有传染性强、传播速度快、抗原易变异等特点。禽流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，其基因组有8个节段的单股负链RNA，编码11个已知蛋白。其中，膜蛋白血凝素是区分多种病毒亚型的依据。根据禽流感病毒致病性的不同，可将其分为高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(LPAI)。近年来在世界各地频发的H7亚型禽流感就属于高致病性禽流感。H7亚型禽流感疫情自2013年出现以来一直没有得到有效的控制。虽然H7N9禽流感病毒还没有进化出人传人的能力，但是禽传人的事例时有发生。2016-2017冬春交接之际我国出现了第五次H7亚型禽流感爆发高峰，这次疫情比以前更为严重，表现为发病时间早和发病率高，并且病毒出现了耐药性突变和毒力增加的现象。针对H7亚型禽流感疫情现状，2017年6月初农业部办公厅发布在两广地区先行开展H7N9免疫工作，为两广地区及全国高效开展禽流感防控工作提供了坚强的技术保障。H7亚型禽流感推广免疫之后，就面临免疫后抗体水平的监测。常规的检测禽流感抗体的方法是血凝抑制(HI)试验。HI试验对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果的判定也有较强的的主观性。因此，研制一种H7亚型禽流感抗体检测试剂盒对我们评价疫苗免疫效果以及及时监测鸡群抗体水平显得极为重要。目前，关于H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的应用相继有报道，主要是在胶体金试纸条、间接免疫荧光、免疫组化等方面的应用，而具有阻断效果的单克隆抗体还未见报道。本专利技术提供一种对H7亚型禽流感病毒抗体有阻断效果的单克隆抗体，具有高灵敏性和特异性。由该单克隆抗体组装的试剂盒与HI试验符合率可达98.9％，为我们进行大规模临场检测提供便利。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度好的抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体，该抗体对H7亚型禽流感病毒抗体有阻断效果，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞1H11分泌得到，该杂交瘤细胞株已于2017年7月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNO：C2017112，分类命名：杂交瘤细胞株1H11，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了一种抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的应用，利用本专利技术的抗体可制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒，用于H7亚型禽流感疫苗免疫效果的评价及鸡群抗体水平的监测。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种分泌抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株1H11的获得是利用灭活的H7-AIV抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术建立抗H7-AIV单克隆抗体杂交瘤细胞库获得的。所述的杂交瘤细胞株已于2017年7月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNO：C2017112，分类命名：杂交瘤细胞株1H11，地址：中国武汉武汉大学。杂交瘤细胞1H11在RPMI-1640完全培养基中，在含5％CO2，37℃条件下培养48小时，显微镜下观察，细胞生长良好，呈葡萄串状、集落浑圆透亮，符合杂交瘤细胞的培养特性。对杂交瘤细胞1H11最高限制代次(F25代)的细胞进行传代稳定性检测，结果每代细胞均能稳定分泌特异性的单克隆抗体，抗体阳性率为100％，并且细胞培养上清的HI抗体效价均在27以上，说明该杂交瘤细胞具有稳定分泌抗体的能力。一种抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的应用，所述的单抗可用于制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒，鉴定待测动物样本是否感染H7亚型禽流感病毒或者待检血清中是否含有H7亚型禽流感病毒抗体。本专利技术的特点和优点如下：1.本专利技术使用的H7-AIV免疫原是购自哈维科的标准抗原，与国家正在进行推广免疫的H7亚型禽流感疫苗同源，用该抗原制备的单克隆抗体组装的试剂盒评价疫苗免疫效果及监测鸡群抗体水平结果更为准确。2.本专利技术从得到的16株分泌抗H7-AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞中，筛选出一株生物特性最好的杂交瘤细胞，用其制备的腹水纯化后对H7-AIV的血凝抑制HI效价为18log2，ELISA效价高达4×105。3.本专利技术得到的1H11单抗，是首次得到的H7亚型禽流感病毒有阻断效果的单抗，可用于制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒应用阻断ELISA方法检测血清样本中的H7亚型禽流感抗体，提高了检测结果的特异性和敏感性。是用该方法检测了大量鸡血清，并用公式(1-样品OD值/阴性对照OD值)来计算血清阻断率，最终确定：鸡血清的阻断率大于或等于0.6判为阳性，小于0.6判为阴性。本方法与HI试验有98％以上的符合率，相对HI试验，缩短了试验时间，操作步骤更简单。具体实施方式本专利技术实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：杂交瘤细胞株1H11的获得：单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立动物免疫取购自哈维科的H7标准抗原一瓶用500μL生理盐水重悬，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射8周龄BALB/c小鼠200μL/只；2周、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；4天后融合。细胞融合骨髓瘤细胞的准备选择生长状态良好的SP2/0细胞，密度长至培养瓶底75％时弃上清，以不完全DMEM培养基洗涤一次后，用l0mL不完全DMEM培养基将细胞轻轻吹下。脾淋巴细胞的准备取加强免疫后4天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈椎脱臼致死小鼠，置75％酒精中10min，腹部朝上固定在超净台内的解剖板；无菌打开腹腔取出脾脏，用不完全DMEM培养基洗涤，去除多余结缔组织和脂肪；随后将脾脏转移到另一个盛有不完全DMEM培养基的平皿中。用研磨棒在细胞筛网上将脾脏磨碎，收集脾细胞悬液。饲养细胞的制备饲养细胞可在融合前一天晚上制备，方法如下：取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，颈椎脱臼处死；置75％酒精中10min，固定四肢，剪开皮肤使腹膜暴露，用酒精棉球擦拭腹膜；用l0mL注射器，12#针头，吸取10mLHAT培养基小心注射到腹腔，持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入己准备好的容器中，计数并稀释后加入96孔细胞培养板中。融合将上述制备的脾细胞与骨髓瘤细胞混合于一支50mL的融合管中，1000g离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37℃水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG1500到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL37℃预热的不完全DMEM培养基终止反应，37℃水浴中静置10min，1000g离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，分装于已铺好饲养细胞的96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株分离的杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞为杂交瘤细胞1H11，保藏编号为：CCTCC NO：C2017112。

【技术特征摘要】
1.一株分离的杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞为杂交瘤细胞1H11，保藏编号为：CCTCCNO：C2017112。2.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。3.权利要求1所述的杂交瘤细...

【专利技术属性】
技术研发人员：范俊青，但汉并，贾慧勤，周云朵，韦奇勇，李盼盼，董晓辉，徐高原，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42