杂交瘤细胞株、所分泌的单克隆抗体及其在检测bar/PAT蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一对杂交瘤细胞株、所分泌的单克隆抗体及其在检测bar/PAT蛋白中的应用。本发明专利技术首先公开了一株分泌单克隆抗体Ab1的杂交瘤细胞株，其微生物保藏编号为CGMCC No.11094。本发明专利技术还公开了一株分泌单克隆抗体Ab2的杂交瘤细胞株，其微生物保藏编号为CGMCC No.11095。本发明专利技术进一步公开一种检测bar/PAT蛋白的免疫胶体金试纸。利用本发明专利技术所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体Ab1和单克隆抗体Ab2制备的免疫胶体金试纸，对bar/PAT蛋白的检测灵敏度和特异性高。本发明专利技术所述杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在抗除草剂转基因植物的检测中具有应用前景。

Hybridoma cell lines, secreted monoclonal antibodies and their application in the detection of bar/PAT protein

The invention discloses a pair of hybridoma cell lines, secreted monoclonal antibodies and their application in the detection of bar/PAT protein. The invention discloses a first monoclonal antibody of Ab1 hybridoma cell lines and its microbial preservation number is CGMCC No.11094. The invention also discloses a monoclonal antibody of Ab2 hybridoma cell lines and its microbial preservation number is CGMCC No.11095. The invention further discloses an immune colloid gold test paper for detecting bar/PAT protein. The immunogold gold test paper prepared by the hybridoma cell line secreted monoclonal antibody Ab1 and monoclonal antibody Ab2 has high sensitivity and specificity for the detection of bar/PAT protein. The hybridoma cell line described in the present invention and its secreted monoclonal antibody have a promising application in the detection of herbicide resistant transgenic plants.

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株、所分泌的单克隆抗体及其在检测bar/PAT蛋白中的应用
本专利技术涉及一对杂交瘤细胞株，还涉及由所述杂交瘤细胞株分泌的一对配对单克隆抗体以及它们在检测bar/PAT蛋白中的用途，属于农业生物

技术介绍
自人类耕作以来，就在探索有效防除杂草的途径，在田间喷洒除草剂是目前最为高效的方式。但因为除草剂能同时导致杂草和作物死亡，带有抗除草剂基因的转基因作物商业化，便成为农业生产中最具优势的性状之一。种植抗除草剂转基因作物可采用窄行间距方法，从而在等同耕作面积上种植更多作物，增加了作物的产量。此外，种植的抗除草剂转基因农作物在使用除草剂后，对田间作物的残留物无需进行处理，减少了劳动力的数量和力度。截至2003年，抗除草剂作物占全球转基因作物的80％以上。从发展趋势上看，转基因的作物比例仍在不断增加。由于抗除草剂标记在商业化转基因植物应用广泛，随着转基因食品的快速发展，国外转基因的作物和食品大量进入中国，转基因的食品检测技术是转基因食品安全性评价的重要技术平台，其研究具有重要的意义。Bialaphos是链霉菌生产的众多抗生素的一种，其化学结构包括谷氨酸异构体(phosphinothricin(PPT))和两个丙氨酸残基(-alanyle-alanine)。Bialaphos是谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase)的抑制剂。通过细胞内切酶的作用去除丙氨酸残基后生成有活性的glufosinate从而抑制谷氨酰胺合成酶的作用，最终导致高浓度的氨在生物体内(包括植物和细菌)聚集而对生物体产生毒理作用。因而，glufosinate成为一种广泛应用的非特异性选择除草剂。某些微生物能够产生一种酶通过对氨基进行乙酰化，从而解毒此效应，这种抗性基因被命名为Bar，名称取自于bialaphosresistance。该基因编码的蛋白可以将phosphinothricin乙酰化变成无毒形式的蛋白膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricinacetyltransferase，PAT)，也有称该基因表达的蛋白为bar/PAT。Bar基因广泛应用于基因工程育种中，也是遗传转化中的标记基因，它使植物抵抗以phosphinothricin为活性成分的除草剂。开展转基因外源蛋白的检测，包括在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，主要的方法有Western、酶联免疫吸附法(ELISA)等。这些方法都受仪器、场地等因素的限制，而且检测时间长，检测成本较高，很难推广应用。因此，实践中需要有一种可快速检测转基因植物中bar/PAT蛋白，且快速检测、操作简便、结果可靠的装置。免疫结合胶体金层析法是免疫金标记技术和抗原抗体反应相结合而形成的一种应用形式，和ELISA类似，只是标记物不同。该法以微孔膜为固相载体，包括双抗体夹心法、双抗原夹心法、捕获法和竟争抑制法等实施方法。双抗体夹心法主要用于检测有多个抗原位点的生物分子。其技术方案包括：首先将已知的特异性抗体以一定的量包被于膜上作为检测带，可与金标物结合的二抗作为质控带。与包被抗体相配对的另一单抗金标结合物则吸附于金标垫上并进行干燥。干燥的金标垫一端与膜相接，一端与样品垫相连。膜的另一侧粘贴吸水垫。检测时，于样品垫加入一定量的液体样本，借助毛细作用，样本沿样品垫到吸水垫的方向移动。它首先经过干燥金标垫，使金标结合物复溶，如标本中含有待测抗原，则发生抗原抗体反应，形成复合物A(金颗粒－抗体－抗原)；复合物A继续移动到达检测带位置，则与包被抗体再次发生抗原抗体反应，形成复合物B(金颗粒－抗体－抗原－包被抗体)，并于检测带的部位聚集，最终达到肉眼可见的程度，如样本中无待检抗原，则不能在检测带形成肉眼可见的红色条带。游离的金标结合物或未被俘获的复合物A越过检测带到达质控带，与可与金标物结合的二抗发生反应，形成复合物C(金颗粒－抗体－二抗)，聚集在质控带并产生肉眼可见的红色条带。无论样本中是否含有待检物质，质控带都会呈现红色条带。免疫结合胶体金层析法具有操作简单、快速、可单份检验、不需要特殊设备的优点，但普遍存在灵敏度低的缺陷。为弥补免疫结合胶体金层析法缺陷，重点在于提高抗单克隆抗体对的灵敏度和特异性。因此，开发具有高特异性和灵敏度，且与其他转基因材料或表达蛋白无交叉反应的抗PAT蛋白单克隆抗体，将对快速有效地检测植物、食品等农产品的转基因成分，以及对公共卫生应急事件的检测等具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一对杂交瘤细胞株，该对杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体构成单克隆抗体对，对bar/PAT蛋白检测的灵敏度和特异性高；本专利技术所要解决的第二个技术问题是将上述一对杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体应用于检测bar/PAT蛋白。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术利用表达纯化的重组bar/PAT蛋白(其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示，编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示)免疫Balb/c雌小鼠，将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选获得111株分泌bar/PAT单抗的阳性杂交瘤细胞株。上述111株细胞株所分泌的单克隆抗体均对重组PAT蛋白具有阳性反应。本专利技术将纯化的111株单克隆抗体两两组合检测，共获得12321组配对单克隆抗体，分别制备胶体金试纸条，排除交叉反应，筛选只针对bar/PAT的高特异性高活性的配对单抗。最终，本专利技术获得具有最佳灵敏度和特异性的第一单克隆抗体Ab1和第二单克隆抗体Ab2。单克隆抗体亚类的鉴定结果显示，单克隆抗体Ab1重链类型为IgG2a，单克隆抗体Ab2重链类型为IgG3；单克隆抗体Ab1和Ab2的轻链均为Kappa链。本专利技术将分泌单克隆抗体Ab1的杂交瘤细胞株1BE6提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.11094；分类命名为：抗Bar单克隆抗体杂交瘤细胞株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2015年08月12日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术将分泌单克隆抗体Ab2的杂交瘤细胞株2CH12提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.11095；分类命名为：抗Bar单克隆抗体杂交瘤细胞株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2015年08月12日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术所获得的一对杂交瘤细胞株，以及单克隆抗体Ab1或单克隆抗体Ab2能够应用于检测抗除草剂转基因植物或其衍生产品(即含有转基因成分的食品、饮品等农产品)。其中，所述抗除草剂转基因植物为转bar/pat基因植物。本专利技术所获得的一对杂交瘤细胞株能够应用于检测bar/PAT蛋白，尤其应用于制备检测bar/PAT蛋白的试剂。本专利技术所述单克隆抗体Ab1或单克隆抗体Ab2能够应用于检测bar/PAT蛋白，尤其应用于制备检测bar/PAT蛋白的试剂。本专利技术进一步公开了一种检测bar/PAT蛋白的免疫胶体金试纸，包括：基膜、吸收垫、胶体金垫、样品垫和被衬底板；所述基膜上设置有C线(质控线)和T线(检测线)，所述C线上包被有羊抗鼠IgG，所述T线上包被有第二单克隆抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株分泌单克隆抗体Ab1的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.11094。

【技术特征摘要】
1.一株分泌单克隆抗体Ab1的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.11094。2.一株分泌单克隆抗体Ab2的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.11095。3.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体Ab1。4.由权利要求2所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体Ab2。5.权利要求1或2所述杂交瘤细胞株在检测抗除草剂转基因植物中的应用。6.权利要求3所述单克隆抗体Ab1或权利要求4所述单克隆抗体Ab2在检测抗除草剂转基因植物中的应用。7.按照权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述抗除草剂转基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：程红梅，刘奇，苏晓峰，郑建，郭惠明，张君，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，刘奇，
类型：发明
国别省市：北京,11