一种A组轮状病毒快速实时荧光RT‑PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种A组轮状病毒快速实时荧光RT‑PCR检测试剂盒，包括扩增引物：正向引物：5’‑gttgatgctcaagatggagt‑3’和反向引物：5’‑acttcattgtaatcatattgaatacc‑3’，还包括特异性荧光探针：5'‑X‑cagcaacaactgcagcttcaaaagaagtgt‑Y‑3'。本发明专利技术所述的试剂盒能够满足针对A组轮状病毒检测中的时效性要求，通过对反应体系中引物、探针、反应条件的设计，并使用了耐热DNA快速聚合酶，结合一步法荧光RT‑PCR技术，达到快速、实时、定量检测A组轮状病毒的目的，灵敏度可达到10

【技术实现步骤摘要】
一种A组轮状病毒快速实时荧光RT-PCR检测试剂盒
本专利技术涉及分子诊断
，具体涉及一种A组轮状病毒快速实时荧光RT-PCR检测试剂盒。
技术介绍
轮状病毒是病毒性肠胃炎中最常见的一种病原体。1973年，澳大利亚学者Bishop等在急性非细菌性肠胃炎儿童十二指肠粘膜的超薄切片中首次发现，1974年将之命名为轮状病毒。(WhiteGB,AshtonCI,RobertsC,ParryHE.1974.Letter:"Rotavirus"ingastroenteritis.Lancet.2(7882):726；BrydenAS,DaviesHA,HadleyRE,FlewettTH..1975.RotavirusenteritisintheWestMidlandsduring1974.Lancet.2(7928):241-3.)这种病原能引发接种动物发生呼吸道感染，并可自感染动物体内分离。轮状病毒属呼肠孤病毒科，为球型，有宽壳盖、短幅和薄边的双链RNA病毒。平均直径70nm左右，病毒体中心为直径36～45nm的致密核心，含核糖核酸。轮状病毒基因含有11个节段。11个段的分子量在0.2-2.2×106MDa范围，总分子量约10-14×106MDa。在所有病毒中唯独轮状病毒的基因组分为11个片段，全长约18550bp，因此可以用聚丙烯酰胺凝胶直接鉴定。每个片段含一个开放读码框架，分别编码6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白(NSP1-NSP5)。按照基因结构和群抗原上差异，RV至少可分A、B、C、D、E、F(G)6(7)个不同的组群。(ChanockSJ,WenskeEA,FieldsBN.1983.HumanrotavirusesandgenomeRNA.JInfectDis.148(1):49-50；KonnoT.1987.Antigendetectionwithmonoclonalantibodies.RinshoByori.35(5):535-8；DesselbergerU,McCraeMA.1994.Therotavirusgenome.CurrTopMicrobiolImmunol.185:31-66.PrasadBV,ChiuW.1994.Structureofrotavirus.CurrTopMicrobiolImmunol.185:9-29.)。轮状病毒在世界各地均有分布，A、B、C组轮状病毒能引起人类和动物腹泻，D-G组只引起动物腹泻。研究最多的是A组轮状病毒，危害性最大，以大范围感染婴幼儿而闻名，有报道称发展中国家每年病例数超过1.3亿，而死亡人数超过87万。这一组病毒根据其表面中和抗原VP7(糖蛋白)或VP4(血凝素)可分14个G血清型和19个P血清型，其中主要流行的血清型为G1P8、G2P4、G3P8和G4P8，在所有就诊病例中占到80％以上。B组轮状病毒(也称成人腹泻轮状病毒)则可引起青壮年胃肠炎的暴发流行。年长儿童和成人常呈无症状感染，通常称病毒携带者。传染源是病人和无症状带毒者，病人每克粪便中排出的病毒体可达1010个。无论在发达或发展中国家，A组RV引起的腹泻都有较高的发病率，是婴幼儿发病和致死的重要病因。在发展中国家，为婴幼儿致死的仅次于呼吸道感染的第二位病因。粪-口是RV传播的主要途径，此外水源污染，呼吸道空气传播，院内和幼托所及家庭成员中的密切接触均可造成流行，还有人推测，动物可能是作为人感染RV的重要传染源。病毒侵入人体后在小肠粘膜绒毛细胞内增殖，病毒外壳蛋白VP4为主要致病因子，它造成细胞溶解死亡，微绒毛萎缩、变短、脱落；腺窝细胞增生、分泌增多，导致严重腹泻，水和电解质的丧失。病毒的潜伏期只有一到两天，然后突然发烧、水样腹泻、呕吐脱水，凭自身免疫可完全恢复。但当婴儿营养不良或已有脱水，若不及时治疗，就会导致婴儿死亡。由于病毒本身变异较大，针对性疫苗难以实现产业化，世界卫生组织(WHO)推荐以预防为主，注意婴幼儿营养和卫生状况来达到降低病毒的感染率。(HamiltonJR.1985.Treatmentofacutediarrhea.PediatrClinNorthAm.32(2):419-27.DiggleL.2007.Rotavirusdiarrhoeaandfutureprospectsforprevention.BrJNurs.16(16):970-4.Posfay-BarbeKM,ZerrDM,PittetD.2008.Infectioncontrolinpaediatrics.LancetInfectDis.8(1):19-31)。传统检测RV感染的方法主要依赖于电镜(EM)或免疫学测定，如酶联免疫吸附(ELISA)等等。现分述如下:1.电镜观察：有时也用免疫电镜和超薄切片电镜检查法，此法在诊断中的作用受到高度评价，但由于受设备限制，较难推广。2.酶免疫吸附试验：双夹心法(doublesandwichmethod)是目前最为常用的检测方法，WHO将此法列为诊断RV的标准方法，国内外都已有相关产品上市销售，但这种快速检测方法的灵敏度有比较大的欠缺。3.PAGE法：RV在粪便中含量高达1010病毒颗粒/克，故可从粪便中直接提取dsRNA、其对RNA酶的降解有强的抵抗力，另外粪便中其它肠道病毒核酸不会进入用于检测RVdsRNA的聚丙烯酰胺凝胶，提取的dsRNA经10％PAGE分离，EB和AgNO3染色后，呈现RV特有的11条带，此法敏感，特异准确可靠，在诊断RV感染，确定流行期病毒种类，病毒漂移和转变及基因重排分析等方面有重要的参考价值。近年随着分子遗传学等的发展，建立了更为特异和敏感的检测方法，如RNA核酸杂交，RT-PCR等用于检测核酸的方法。核酸探针杂交是从标本中提取病毒dsRNA，在溶液中或在固相支持物上(如NC膜或尼龙膜)，与其互补的P2标记的DNA或RNAprobe进行杂交，通过检测标记的probe观察是否有阳性杂交反应，杂交的敏感性与probe序列的长度成正比。而逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法是针对基因的保守序列，合成两个引物，将抽提mRNA一步法进行体外扩增，加上特异性荧光探针的配合使用，可即时证实RV的存在。由于此方法操作简单易行，而且准确灵敏，适用于商品化试剂盒。目前这个方法开发的试剂盒，逆转录到完成PCR检测至少需要2个小时，但A组轮状病毒感染者以门诊病人为主，且发病急，因此急需开发一种可以快速检测样本中的A组轮状病毒核酸的产品。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术不足，提供了一种快速检测A组轮状病毒核酸的试剂盒，特别是涉及以一步法快速实时荧光RT-PCR技术早期、快速诊断A组轮状病毒感染的试剂盒。本试剂盒可以在30分钟内检测出粪便样本中的A组轮状病毒。本专利技术的目的是提供一种使用一步法快速实时荧光RT-PCR技术检测样品中A组轮状病毒的试剂盒，特别是涉及A组轮状病毒的早期感染在医院门急诊中的应用。其基本原理是利用一对寡核苷酸的特异性引物和一条寡聚核苷酸的特异性探针，在包含逆转录酶、耐热DNA快速聚合酶、RNA酶抑制剂(RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种A组轮状病毒快速实时荧光RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：正向引物：5’‑gttgatgctcaagatggagt‑3’，SEQ ID NO:1；反向引物：5’‑acttcattgtaatcatattgaatacc‑3’，SEQ ID NO:2；特异性荧光探针：5'‑X‑cagcaacaactgcagcttcaaaagaagtgt‑Y‑3'，SEQ ID NO：3，其中X表示荧光发生基团，Y表示荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种A组轮状病毒快速实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：正向引物：5’-gttgatgctcaagatggagt-3’，SEQIDNO:1；反向引物：5’-acttcattgtaatcatattgaatacc-3’，SEQIDNO:2；特异性荧光探针：5'-X-cagcaacaactgcagcttcaaaagaagtgt-Y-3'，SEQIDNO：3，其中X表示荧光发生基团，Y表示荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述荧光发生基团为6-FAMamidite、HEX或Cy5，所述荧光淬灭基团为BHQ1。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于正向引物：反向引物：特异性荧光探针的摩尔比为2：2：1。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括快速RT-PCR反应液、阴性质控品和阳性质控品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈峰，陈琳，徐聪灵，蔡丽萍，唐晓宇，吴尔翔，
申请(专利权)人：中华人民共和国南通出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：江苏,32