长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1 表达检测引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码RNA lnc‑ALVE1‑AS1表达检测引物及试剂盒。所述引物包括链特异性RT引物和荧光定量PCR检测引物；其中链特异性RT引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；荧光定量PCR检测引物的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。本研究发明专利技术还提供了lnc‑ALVE1‑AS1表达检测试剂盒，为lnc‑ALVE1‑AS1表达规律分析提供了方法和基础，在生产实践可用于检测鸡群的禽白血病天然免疫状态。

Long chain RNA LNC ALVE1 encoding non expression AS1 detection primer and kit

The invention belongs to the field of molecular biology, in particular to a long chain of non expression of RNA encoding LNC ALVE1 AS1 detection primer and kit. The primers include chain specific RT primers and fluorescent quantitative PCR detection primer; such as SEQ ID and SEQ NO.8 ID NO.9 sequence shown in the strand specific RT primer sequence; fluorescence quantitative PCR detection primers as shown in SEQ ID and SEQ NO.10 ID NO.11. The invention also provides a LNC ALVE1 AS1 expression detection kit, provides the method and basis for the LNC ALVE1 AS1 expression pattern analysis in practice can be used to detect natural immune status of avian leukosis in chickens.

【技术实现步骤摘要】
长链非编码RNAlnc-ALVE1-AS1表达检测引物及试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码RNAlnc-ALVE1-AS1表达检测引物及试剂盒。
技术介绍
内源性反转录病毒(endogenousretroviruses)是基因组成分，被认为源于进化中感染生物体的反转录病毒。作为远古反转录病毒感染在宿主体内的残留，加之过去对它的功能不够了解，曾将其视为垃圾DNA(JunkDNA)。直至最近有研究表明，某些内源性反转录病毒不仅对早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性具有重要作用，还可能与细胞天然免疫有关。最新研究发现，内源性反转录病毒转录物是长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)的重要来源，具有激活干扰素应答反应的潜能。事实上，lncRNA在细胞生物学调控中的作用越来越受到重视，在抗病毒天然免疫中也具有重要调节作用。内源性反转录病毒衍生的lncRNA在对抗外源性反转录病毒增殖的作用机制将逐渐被阐明，有望成为抵抗外源性病毒的新型疫苗或免疫增强剂。禽内源性白血病病毒ALVE是最早发现的内源性反转录病毒，可能与宿主免疫应答和遗传抗性有关。特别是，来源于鸡1号染色体上的内源性反转录病毒ALVE1(长度为7.5kb)与禽白血病病毒高度同源，可能与禽白血病病毒的感染和增殖具有一定关联。
技术实现思路
本专利技术通过高通量测序在鸡基因组中鉴定出一条禽内源性反转录病毒ALVE1衍生的反义长链非编码RNA，命名为lnc-ALVE1-AS1。研究表明，lnc-ALVE1-AS1可以激活细胞抗病毒干扰素应答反应并抑制与其高度同源的外源性J亚群禽白血病病毒增殖。因此，进一步了解lnc-ALVE1-AS1在不同抗性品系鸡中的表达规律显得尤为重要。本专利技术的目的是提供一种能检测lnc-ALVE1-AS1表达的检测引物及试剂盒。本专利技术提供了一种用于长链非编码RNAlnc-ALVE1-AS1表达检测的引物，包括链特异性RT引物和荧光定量PCR检测引物；所述链特异性RT引物的序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示；所述荧光定量PCR检测引物的序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示。本专利技术进一步公开了上述引物在制备lnc-ALVE1-AS1表达检测试剂盒中的应用。一种长链非编码RNAlnc-ALVE1-AS1表达检测试剂盒，包括链特异性RT引物、逆转录试剂、荧光定量PCR检测引物和定量PCR检测试剂；所述链特异性RT引物的序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示；所述荧光定量PCR检测引物的序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示。本专利技术提供的检测lnc-ALVE1-AS1表达规律的表达检测试剂盒，为检测lnc-ALVE1-AS1的表达规律提供了研究方法和基础。此外，在生产实践可用于检测鸡群的禽白血病天然免疫状态。附图说明图1是lnc-ALVE1-AS1荧光定量PCR检测结果图。图2是lnc-ALVE1-AS1在鸡1号染色体上的位置示意图。图3是lnc-ALVE1-AS1激活抗病毒干扰素应答反应图。A：过表达lnc-ALVE1-AS1对病原模式识别受体基因表达的影响；B：过表达lnc-ALVE1-AS1对干扰素刺激基因表达的影响；C：过表达lnc-ALVE1-AS1对TLR3蛋白表达的影响。图4是lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖图。A：过表达lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达；B：过表达lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒滴度；C：间接免疫荧光共聚焦实验分析lnc-ALVE1-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1lnc-ALVE1-AS1全长序列的测定(1)鉴定lnc-ALVE1-AS1的5′和3′末端序列主要由Takara公司提供的RACE5’/3’Kit试剂盒来完成。首先，用Reagent提取总RNA，然后用RNase-freeDNaseI去除基因组。在SMARTScribeReverseTranscriptase(试剂盒提供)的作用下分别将1μg去除基因组的RNA逆转录合成5′-或3′-RACE产物。然后，按照RACE5’/3’Kit试剂盒的操作说明，利用通用引物UPM分别与5′-末端或3′-末端基因特异性引物(gene-specificprimer，GSP)进行PCR扩增，克隆测序获得lnc-ALVE1-AS1的5′末端和3′末端序列。其中，所用5′-末端或3′-末端基因特异性引物的核苷酸序列如下：5’GSP：5′-TGACGGGATGGGACACAACGCTAAACAGT-3′(SEQIDNO.6)3’GSP：5′-GATTCGCCGCTCCGTTGCTGGTTTCTC-3′(SEQIDNO.7)。(2)常规PCR扩增lnc-ALVE1-AS1产物。其中，所用引物lnc-ALVE1-AS1-F和lnc-ALVE1-AS1-R的核苷酸序列如下：lnc-ALVE1-AS1-F：5′-ATCTTTATGTTCCATTGTCATCGC-3′(SEQIDNO.2)lnc-ALVE1-AS1-R：5′-GCCATTTTACCATCCACCAC-3′(SEQIDNO.3)其反应体系包括：100ng鸡胚成纤维细胞cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物lnc-ALVE1-AS1-F与1μL(10μM)lnc-ALVE1-AS1-R分别作为扩增引物，1μLDNAPolymerase，10μL5xSFBuffer，1μL(10μM)dNTPMix和32μLddH2O。其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持。(3)TA克隆测序获得lnc-ALVE1-AS1的全长cDNA序列，该序列在鸡1号染色体上的位置示意图见图2。具体cDNA序列如SEQIDNO.1。实施例2lnc-ALVE1-AS1过表达载体构建本实施例2中，使用从实施例1中所获得的lnc-ALVE1-AS1全长序列，构建lnc-ALVE1-AS1过表达质粒。具体包括如下步骤：(1)从AZA处理96小时的鸡胚成纤维细胞中，使用Reagent提取总RNA，然后用RNase-freeDNaseI去除基因组。使用PrimeScriptRTreagentKit试剂盒将其逆转录成cDNA产物。(2)以实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物为模板，使用高保真酶扩增lnc-ALVE1-AS1全长序列，其中，所用引物lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F和lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R的核苷酸序列如下：lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F:5′-aagcttATCTTTATGTTCCATTGTCATCGCTAAC-3′(SEQIDNO.4)lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R:5′-tctagaGCCATT本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于长链非编码RNA lnc‑ALVE1‑AS1表达检测的引物，其特征在于，包括链特异性RT引物和荧光定量PCR检测引物；所述链特异性RT引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述荧光定量PCR检测引物的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

【技术特征摘要】
1.用于长链非编码RNAlnc-ALVE1-AS1表达检测的引物，其特征在于，包括链特异性RT引物和荧光定量PCR检测引物；所述链特异性RT引物的序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示；所述荧光定量PCR检测引物的序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示。2.一种长链非编码RNAlnc-ALVE1-AS1表达检...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔恒宓，胡序明，陈世豪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32