一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物及检测方法技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，特别涉及一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物，见序列表中序列1‑6。使用LAMP引物进行扩增，如有扩增结果，则待检样品中含有猪圆环病毒3型，如无扩增结果，则待检样品中不含有猪圆环病毒3型。该方法敏感特异，简便快速，可用于PCV3检测和临床诊断。

A LAMP primer and detection method for detection of porcine circovirus type 3

The present invention relates to the technical field of virus detection, in particular to a LAMP primer for detection of porcine circovirus type 3, see the sequence in a sequence table 1 6. LAMP primers were used to amplify. If the results were amplified, the porcine circovirus type 3 was detected in the samples. If there was no amplification result, there was no porcine circovirus type 3 in the samples to be tested. This method is sensitive, specific, simple and rapid, and can be used for PCV3 detection and clinical diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物及检测方法
本专利技术涉及病毒检测
，特别涉及一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物，还涉及猪圆环病毒3型的LAMP检测方法。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属成员。该病毒有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍综合征、腹泻及先天性震颤等多种临床疾病，给全球养殖业带来了巨大的经济损失。但猪皮炎肾病综合征(PDNS)的病原一直受到争议。近年来，美国学者等首先发现繁殖障碍母猪、PDNS、猪心肌炎和多系统炎症病变组织中存在一种新的猪圆环病毒，其Cap基因序列与PCV2同源性仅24％-26％，命名为PCV3。我国学者采用PCR方法从临床发病猪肺脏和淋巴结组织样品检出PCV3，证明我国存在该病毒。现有的猪圆环病毒检测，主要集中在1型和2型，方法有PCR方法、ELISA抗体检测、介导等温扩增快速检测方法，如CN104725490A公开了一种猪圆环病毒2型(PCV2)全长Cap蛋白的制备方法及以该Cap蛋白为抗原的ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒含有包被上述猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的酶标板，以及含有样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶结合物、酶底物溶液、终止液和阴、阳性对照血清，用于检测PCV2时不仅特异性强、敏感性高，同时可大规模推广应用。CN101307367本专利技术属于动物医学领域,公开了一种关于猪圆环病毒2型的环介导等温扩增快速检测方法,通过使用特异性引物,利用环介导等温扩增技术(LAMP)平台扩增靶序列的特定区域,在一系列质控和阴性、阳性对照的辅助下,从分子水平对包括猪圆环病毒2型的病毒核酸进行检测,本专利技术的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点,具有广阔的应用前景。而对猪圆环病毒3型的检测，主要有PCR检测、荧光定量PCR检测，如CN107083450A公开了猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒及检测方法。所述猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒，包括：DNA提取试剂、2×TaqPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo.2所示，利用所述试剂盒的PCR检测方法，能够快速、特异的检测猪圆环病毒3型。CN106929607A本专利技术公开了一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对、方法及试剂盒。该引物对由上游引物和下游引物组成，序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。试剂盒包括所述引物对，还可以包括其他检测试剂。所述检测猪圆环病毒3型病毒的方法，是以待测样品的基因组DNA为模板，利用引物对或试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，根据熔解曲线和扩增曲线Cq值进行结果判读。本专利技术准确性高、特异性好、重复性好、操作简便，可以准确、快速、高效地进行鉴定PCV3，有利于在临床实践中推广应用。未有猪圆环病毒3型的环介导等温扩增检测记载。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)具有经济实用、高效、快速和简便等特点，已经用于多种猪病原检测，如猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病毒等，但尚无PCV3LAMP检测方法报道。本研究根据PCV3基因序列，设计特异引物，成功建立了一种PCV3LAMP检测方法，56℃恒温条件下35min内即可直接通过肉眼判定，并具有较高特异性和敏感性。因此，研究一种猪圆环病毒3型的环介导等温扩增检测方法，在猪圆环病毒3型的检测中，是非常必要的。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中无猪圆环病毒3型的环介导等温扩增检测方法的问题，本申请公开了一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物。本专利技术还提供了猪圆环病毒3型的LAMP检测方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物，碱基序列如下：F3：5’-TCCAGTTTTTTCCGGGACAT-3’，(见序列表中序列1)B3：5’-AACACTTGGCTCCAAGACG-3’，(见序列表中序列2)FIP：5’-CTTTTTCTCCAGACCCACCCCA-AAAGCAGTGCTCCCCATTG-3’，(见序列表中序列3)BIP：5’-TTCCCGCCAGAATTGGTTTCGG-GCGGAAAGTTCCACTCGTAA-3’，(见序列表中序列4)LF：5’-ACACATATGACCCCACCGT-3’，(见序列表中序列5)LB：5’-GGTGAAGTAACGGCTGTGTTT-3’。(见序列表中序列6)一种猪圆环病毒3型的检测方法，提取待检样品DNA，使用权利要求1中的LAMP引物进行扩增，如有扩增结果，则待检样品DNA中含有猪圆环病毒3型，如无扩增结果，则待检样品DNA中不含有猪圆环病毒3型。所述的检测方法，优选25μL最佳反应体系成分为：10×ThermopolBuffer2.5μL，MgSO4(100mmol·L-1)1.5μL，dNTP(10mmol·L-1)3.5μL，外引物F3/B3(4μmol/L)各1μL，内引物FIP/BIP(40μmol/L)各为1μL，环引物LF/LB(10μmol/L)各为1μL，BstDNA聚合酶(8000U/mL)1.0μL，甜菜碱(Betaine)2μL，灭菌ddH2O6.5μL，模板cDNA1.5μL。所述的检测方法，优选反应温度为59℃，反应时间为36min。所述的检测方法，优选使用SYBRGreenⅠ染料进行显色。所述的检测方法，检测限为1.0×101copies/μL。本专利技术的有益效果：该方法最低检测限为1.0×101copies/μL，与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒1和2型(PCV1，PCV2)等均无交叉反应。该方法用于检测呼吸道病猪淋巴结样品68份，PCV3阳性率30.9％，与PCR检测结果符合率为95.6％(65/68)。该方法敏感特异，简便快速，可用于PCV3检测和临床诊断。附图说明图1为PCV3LAMP反应体系和条件优化结果，A:dNTP浓度优化；B:Mg2+优化；C:甜菜碱优化；D:内外引物浓度比优化；E:温度优化；F:时间优化图2为LAMP反应敏感性试验，A:LAMP电泳结果；B:RT-PCR；C:LAMP-SYBRGreenⅠ显色。M:DL2000DNA分子质量标准；1～9:107～100.01基因拷贝/mL；10:阴性对照图3为LAMP特异性试验结果，A：LAMP检测不同病原电泳结果：M:DNAmarkerDL2000；1-7:1.Negativecontrol；2.CSFV；3.PEDV；4:PCV1；5:PCV2a+2b；6:PRV；7:PCV3,8.PRRSV,respectively，B.LAMP反应产物内切酶酶切产物电泳结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：实施例11材料和方法1.1病毒、重组质粒和病料病毒：PCV3、PCV1、PCV2a、PCV2b、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)等均由本实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物，其特征在于碱基序列如下：F3：5’‑TCCAGTTTTTTCCGGGACAT‑3’，B3：5’‑AACACTTGGCTCCAAGACG‑3’，FIP：5’‑CTTTTTCTCCAGACCCACCCCA‑AAAGCAGTGCTCCCCATTG‑3’，BIP：5’‑TTCCCGCCAGAATTGGTTTCGG‑GCGGAAAGTTCCACTCGTAA‑3’，LF：5’‑ACACATATGACCCCACCGT‑3’，LB：5’‑GGTGAAGTAACGGCTGTGTTT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物，其特征在于碱基序列如下：F3：5’-TCCAGTTTTTTCCGGGACAT-3’，B3：5’-AACACTTGGCTCCAAGACG-3’，FIP：5’-CTTTTTCTCCAGACCCACCCCA-AAAGCAGTGCTCCCCATTG-3’，BIP：5’-TTCCCGCCAGAATTGGTTTCGG-GCGGAAAGTTCCACTCGTAA-3’，LF：5’-ACACATATGACCCCACCGT-3’，LB：5’-GGTGAAGTAACGGCTGTGTTT-3’。2.一种猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于待检样品，使用权利要求1中的LAMP引物进行扩增，如有扩增结果，则待检样品中含有猪圆环病毒3型，如无扩增结果，则待检样品中不含有猪圆环病毒3型。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：白娟，姜辰龙，姜平，张日腾，李勇，严秀文，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32