一种用于检测23种呼吸道病原体的组合物、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测23种呼吸道病原体的组合物，其包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.48所示序列组成的引物组合物对以及SEQ ID No.49～SEQ ID No.72所示序列组成的探针组合物。本发明专利技术还涉及一种用于检测23种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括分别含有上述引物和探针的第一反应液、第二反应液、第一杂交液和第二杂交液，其还包括混合酶、链霉亲和素‑藻红蛋白溶液、阴性参考品、阳性参考品和内标。本发明专利技术的试剂盒和检测方法整合了RT‑PCR、全自动液相芯片杂交检测和数据分析等功能，同时具有通量高、检测靶点数多、自动化程度高、操作简便，及同类液相芯片技术发明专利技术中耗时短等优势，其为及时应对呼吸道感染疫情提供重要信息，对呼吸道病原体的防治具有重要意义。

A composition, kit and detection method for detecting 23 kinds of respiratory pathogens

The invention relates to a composition for the detection of 23 respiratory pathogens, including SEQ ID probe primer composition composition No.1 ~ SEQ ID No.48 shown on SEQ and consists of a sequence of ID No.49 ~ SEQ ID No.72 shown consists of a sequence of. The invention also relates to a kit for the detection of 23 respiratory pathogens and its detection method, the kit includes respectively containing the primer and probe the first reaction liquid, second reaction solution, the first hybrid solution and second hybrid liquid, which also includes mixed enzyme, streptavidin phycoerythrin solution and negative reference positive reference and internal standard. The kit and the detection method of the invention integrates the RT function PCR, hybridization and data analysis of automatic liquid chip with high flux and detection of target points, high degree of automation, simple operation, and similar liquid chip technology invention in short time and other advantages, it is a timely response to the epidemic of respiratory tract infection provide important information on the importance of prevention and treatment of respiratory pathogens.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测23种呼吸道病原体的组合物、试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及核酸检测
，尤其涉及一种用于检测23种呼吸道病原体的组合物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
目前临床用于病毒检测的方法主要有：病原体的培养和分离，免疫学检测和核酸检测。核酸检测法是通过分子生物学方法对病原体特异的核酸序列进行检测的方法，其主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR、核酸测序和基因芯片等方法。其中与本专利技术最为接近的技术为基因芯片法。核酸检测法是通过分子生物学方法对病原体特异的核酸序列进行检测的方法。核酸检测法中，普通PCR方法一般需要对扩增产物进行凝胶电泳，检测步骤多，时间长，且只能从定性的角度进行分析，灵敏度也相对不够。应用较多的实时荧光定量PCR技术具有操作简单、灵敏度高、且能对感染的病原体进行定量检测的优点，但受限于现有仪器设备以及可用的染料，荧光定量PCR技术无法做到5重以上检测，对于呼吸道复杂多样病原体的检测来说，荧光PCR技术也无法提高检测效率。核酸测序的方法是物种定位最为精确的方法。但一代测序的方法检测灵敏度偏低，检测周期长，且无法实现多重检测，对仪器和操作人员的要求也比较高。二代测序的方法虽然在检测通量上有了质的飞跃，但整体技术非常复杂，对检测人员的专业水平要求很高，检测周期长，且设备和试剂成本均相对较高；若需达到一定的检测灵敏度，需要对样本进行深度的测序，也进一步增加了测序的成本。基因芯片方法是基于核酸杂交的原理，通量高、可一次检测多种病原体、且结果分析速度快，这一点对于呼吸道多种病原体的快速检测非常有优势。基因芯片又称DNA微阵列(DNAMicroarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的成千上万个核酸分子所组成的微阵列。基因芯片是根据核酸的分子杂交衍生而来的技术，即应用固体表面上集成已知序列的基因探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测。样品与探针杂交后，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，对每一个探针上的荧光信号进行分析，得出结果。基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备，样品制备，杂交反应、洗涤和信号检测与结果分析。芯片制备：目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。样品制备：对样本中的核酸进行提取和纯化后进行PCR扩增，并同时进行荧光标记。杂交反应：荧光标记的样品在合适的杂交条件下与芯片上的互补探针进行反应并产生一系列信息。洗涤：用合适的冲洗液对未能与探针牢固结合的样品DNA冲洗干净。信号检测与结果分析：芯片扫描仪对芯片上各个反应点的荧光位置和荧光强弱进行扫描并生成图像，相关软件对图像进行分析，将荧光信号与相应的位置转换成数据，即可获得检测结果。但传统的固相芯片制作较为复杂，且对样本的浓度要求比较高，一般也很难达到较高的灵敏度。所以在此基础上发展起来的液相芯片技术，秉承了其高通量检测的优势，且有效解决了检测灵敏度差的壁垒，对呼吸道复杂多样的病原体检测尤为适合。在基因芯片技术上发展起来的液相芯片技术抛弃了原有的固相载体，取而代之的是悬浮在液态中的微球。液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球构成，每种微球上固定有不同的探针分子，不同种类的微球带有不同的荧光染料编码，分子杂交在悬浮溶液中进行。与固相芯片技术一样，液相芯片也可以同时检测多种病原体，一次实验即可得到全部结果。但反应效率更高，检测灵敏度也更高。在当前较为相近的两份专利中，中国专利(CN102181576A)公开了一种用液相芯片检测呼吸道传染病病原的引物和探针及方法，其检测靶点数少，只有9个靶点，且需要进行两次PCR，操作较繁琐；中国专利(CN103205509A)公开了一种基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法，其检测靶点数为13个，耗时7小时，其检测靶点数少，且耗时长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，基于美国AppliedBio-Code公司全自动液相芯片杂交检测技术平台(ABCHTS3000)进行呼吸道病原体检测试剂盒的研制，本专利技术整合了RT-PCR、全自动液相芯片杂交检测和数据分析等功能，同时具有通量高、检测靶点数多、自动化程度高、操作简便，及同类液相芯片技术专利技术中耗时短等优势，其为及时应对呼吸道感染疫情提供重要信息。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是一种用于检测23种呼吸道病原体的组合物，其特征在于，包括SEQIDNo：1～SEQIDNo：48所示序列组成的引物组合物对以及SEQIDNo：49～SEQIDNo：72所示序列组成的探针组合物。为了进一步优化上述组合物，本专利技术还包括如下措施：进一步地，所述引物组合物中的每一下游引物的5'端均添加SEQIDNo：73所示序列的通用引物，其中所述通用引物的5'端采用Biotin修饰。进一步地，所述探针组合物中还包括SEQIDNo.74所示序列的校正探针，其中所述探针组合物中每一探针的5'端均采用amino-C6修饰。进一步地，所述探针组合物中的每一探针均分别与不同的磁珠偶联。具体而言，在本专利技术一特定实施例中，根据病原体种类及检测效果，将23种病原体分为两组。第一组包括流感病毒A型(FluA、sH1、09H1、H3、N1、H5、H7、N9)、流感病毒B型(FluB)、副流感(PIVⅠ)、副流感Ⅲ(PIVⅢ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(M.p)、肺炎衣原体(C.p)；第二组包括副流感Ⅱ(PIVⅡ)、副流感Ⅳ(PIVⅣ)、腺病毒(ADV)、鼻病毒(HRV)/肠病毒(EV)、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、人偏肺病毒(hMPV)、博卡病毒(BoCa)。针对上述23个病原体在NCBI中下载所有序列并进行同源性比对分析，设计特异性引物和探针。本专利技术所述引物是由通用引物和特异性引物组合而成的嵌合引物，即在特异性引物的5'端添加一段通用引物序列(采用Biotin修饰)。本专利技术所述特异性探针是在序列的5'端进行amino-C6修饰。其中，特异性引物为：第一组：FluA，SEQIDNO.1～2；sH1，SEQIDNO.3～4；09H1，SEQIDNO.5～6；H3，SEQIDNO.7～8；N1，SEQIDNO.9～10；H5，SEQIDNO.11～12；H7，SEQIDNO.13～14；N9，SEQIDNO.15～16；FluB，SEQIDNO.17～18；PIVⅠ，SEQIDNO.19～20；PIVⅢ，SEQIDNO.21～22；RSV，SEQIDNO.23～24；M.p，SEQIDNO.25～26；C.p，SEQIDNO.27～28；通用引物(UniR-biotin)：SEQIDNO.73；第二组：PIVⅡ，SEQIDNO.29～30；PIVⅣ，SEQIDNO.31～32；ADV，SEQIDNO.33～34；HRV/EV，SEQIDNO.35～36；NL63，SEQIDNO.37～38；OC43，SEQIDNO.39～40；229E，SEQIDNO.41～42；HKU1，SEQIDNO.43～44；hMPV，SEQIDNO.45～46；BoCa，SEQIDNO.47～48；通用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测23种呼吸道病原体的组合物，其特征在于，包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.48所示序列组成的引物组合物对以及SEQ ID No.49～SEQ ID No.72所示序列组成的探针组合物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测23种呼吸道病原体的组合物，其特征在于，包括SEQIDNo.1～SEQIDNo.48所示序列组成的引物组合物对以及SEQIDNo.49～SEQIDNo.72所示序列组成的探针组合物。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述引物组合物中的每一下游引物的5'端均添加SEQIDNo.73所示序列的通用引物，其中所述通用引物的5'端采用Biotin修饰。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述探针组合物中还包括SEQIDNo.74所示序列的校正探针，其中所述探针组合物中每一探针的5'端均采用amino-C6修饰。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述探针组合物中的每一探针均分别与不同的磁珠偶联。5.一种用于检测23种呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4中任一项所述的用于检测23种呼吸道病原体的组合物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一反应液、第二反应液、第一杂交液和第二杂交液；其中，所述第一反应液包含SEQIDNo.1～SEQIDNo.28所示序列的引物、SEQIDNo.73所示序列的采用Biotin修饰的通用引物、内标引物和5xbuffer缓冲液；所述第二反应液包含SEQIDNo.29～SEQIDNo.48所示序列的引物、SEQIDNo.73所示序列的采用Biotin修饰的通用引物、内标引物和5xbuffer缓冲液；所述第一杂交液与第一反应液相对应，其包含SEQIDNo.49～SEQIDNo：62所示序列的探针与不同磁珠的耦联产物以及杂交液；所述第二杂交液与第二反应液相对应，其包含SEQIDNo.63～SEQIDNo：72所示序列的探针与不同磁珠的耦联产物以及杂交液。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述5xbuffer缓冲液包括1MpH8.8Tris-HCl(MDx)-1、2M(NH4)2SO4(MDx)-1、2MKCl(MDx)-1、1MMgCl2(MDx)-1、Tween20-1(10％)、dATP-1(100mM)、dCTP-1(100mM)、dGTP-1(100mM...

【专利技术属性】
技术研发人员：董万强，何晓辉，张平，林敏，
申请(专利权)人：苏州新波生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32