本发明专利技术公开了一种检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT‑PCR试剂盒，提供了用于检测H7N9病毒经典毒株和变异毒株血凝素(HA)特异性基因的引物对和MGB探针，用于检测H7N9病毒神经氨酸酶基因(NA)的引物对和MGB探针，以及包括它们的试剂盒和试剂盒使用方法。本试剂盒的原理是：以H7N9禽流感病毒变异毒株的HA突变基因为分子标识，结合保守的神经氨酸酶(NA)基因，制备H7N9病毒经典毒株和变异毒株多重荧光检测试剂盒。本试剂盒可快速甄别H7N9禽流感病毒经典毒株和高致病性变异毒株，为H7N9禽流感病毒变异早期预警提供了强有力的技术支撑，可广泛应用于动物检验检疫、流行病学调查、疫病防控等领域。
【技术实现步骤摘要】
检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试剂盒
本专利技术涉及一种检测H7N9流感病毒的试剂盒，特别涉及一种用于检测H7N9流感病毒低致病性毒株(经典毒株)和高致病性毒株(变异毒株)的多重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，属于生物制品检测
技术介绍
流感病毒属于正粘病毒科，基因组是单股、负链、多节段的核糖核酸(RNA)分子。根据流感病毒核蛋白(NP)抗原性差异，可将流感病毒分为A、B、C三型，其中A型流感病毒为最常见的流感病毒，宿主范围广泛，可感染大多数哺乳动物、家禽以及野鸟。根据流感病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)氨基酸的差异，又可将A型流感病毒分为18个HA亚型和11个NA亚型。禽流感病毒属于A型流感病毒，根据致病能力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)、低致病性禽流感(Lowpathogenicavianinfluenza,LPAI)和非致病性禽流感(Non-pathogenicavianinfluenza,NPAI)。HPAI传染性极强，以高发病率和高致死率为特征，对禽类养殖业危害巨大，因此世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的动物疾病，中国政府也将其列为一类动物疫病。目前，引起HPAI的毒株主要集中在H5和H7亚型。2013年，我国上海市、安徽省、江苏省和浙江省等东南沿海地先后发生H7N9禽流感病毒感染人事件，并引起死亡。2017年，H7N9流感进一步蔓延，仅1月份全国“人感染H7N9禽流感”发病数为192，死亡数为79，给公共卫生安全造成严重影响。2017年，广东省疾病预防控制中心从人感染H7N9病例分离到变异毒株，病毒的血凝素基因发生插入性突变。随后中国疾病预防控制中心组织专家解析，并与农业部门专家沟通后认为，该位点的突变，提示H7N9病毒突变为对禽类高致病性的病毒，会导致禽更易发病、死亡。至此，H7N9病毒与H5N1、H9N2等禽流感病毒类似，对禽类和公共卫生构成了双重威胁。依据《动物H7N9禽流感紧急监测方案(农医发201313号)》和《高致病性禽流感防治技术规范(GB19442-2004)》文件要求，H7N9的病原学检测采用RT-PCR方法。目前市售的H7N9核酸检测试剂，多为单独针对H7N9禽流感病毒的HA基因或NA基因，无法同时鉴别区分H7N9病毒经典毒株和变异毒株，检测效率低。多重荧光PCR设计难度大，比如说扩增三个片段需要六条引物和三个探针，这对引物和探针的特异性要求极高。这些引物和探针不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合，而且不同探针还要携带不同的荧光基团以便区分。综上所述，为加强对变异毒株的监测，建立了一套能够同时检测H7N9经典毒株和新型变异毒株的多重荧光PCR方法具有重要的实践意义，能够为H7N9禽流感的流行病学监测和早期预警提供强有力的技术支撑和储备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测H7N9禽流感病毒经典毒株和变异毒株的多重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，利用多重荧光RT-PCR技术，可快速、高效地甄别人和动物中的H7N9低致病性经典毒株和高致病性变异毒株。该试剂盒的机理是：以H7N9禽流感病毒血凝素(HA)突变位置的基因序列为分子标识设计MGB探针，建立H7N9流感病毒经典毒株和变异毒株血凝素(HA)双重检测体系，然后结合保守的神经氨酸酶(NA)基因检测体系，最终组成H7N9禽流感病毒经典毒株和变异毒株的三重荧光RT-PCR检测试剂盒。本专利技术可以通过以下技术方案来实现。一种检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有吸附柱、收集管、裂解液、洗液和洗脱液，B盒含有阳性对照、阴性对照、RT-PCR反应液A和RT-PCR反应液B；所述RT-PCR反应液B中有2对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增H7N9禽流感病毒HA和NA基因片段，探针分别用于识别H7N9病毒HA基因、H7N9变异毒株HA基因和H7N9病毒的NA基因。A盒用于病毒RNA的提取，0-4℃保存；B盒用于RNA的逆转录和PCR扩增反应，-20℃保存。在一具体实施例中：用于检测H7N9病毒HA基因的引物对及其探针序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’H7-P：5’-ROX-ACATAGATAGCAGGGC-BHQ2-MGB-3’ROX为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团；用于检测H7N9变异毒株HA基因的引物对及其探针序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’H7变异-P：5’-FAM-AGAGAAAACGGACTGC-BHQ1-MGB-3’FAM为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团；其中用于检测H7N9病毒NA基因的引物对及其探针序列如下：N9-F：5’-ATGCCCAGTAGTGTTCACCG-3’N9-R：5’-TGTCCTCCCTAGCCAAGTGT-3’N9-P：5’-VIC-GTCTCTGACTGGAACT-BHQ1-MGB-3’VIC为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团；本专利技术的积极效果是：1.本专利技术首次制备了一种同时检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的三重荧光RT-PCR试剂盒。应用本试剂盒可同时鉴定禽流感病毒H7亚型HA基因、禽流感病毒N9亚型NA基因和禽流感病毒高致病性变异毒株H7亚型HA基因。相对于市场上其他核酸检测试剂，本试剂盒为H7N9流行病学监测与防控提供了高效的检测工具。2.本专利技术试剂盒使用MGB-Taqman探针，克服了多重PCR引物、探针、目的产物相互干扰等问题。原因如下：(1)探针3’末端使用BHQ作为淬灭基团，而BHQ本身不产生荧光，所有荧光背景低，灵敏度高；(2)在传统Taqman探针基础上，MGB-Taqman探针在3’末端偶联MGB(MinorGrooveBinder)。MGB能够与DNA的小沟结合，使探针与靶DNA形成极为稳定的异源双链，从而可将Tm值提高约10℃，大大提高了荧光PCR方法的特异性；(3)MGB探针较短(14-20bp)，因而更适合于短小变异序列的特异性识别，容易设计。而且3’端淬灭基团与3’端报告基因在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。3.本专利技术采用RNA柱式提取法替代传统的实验室RNA提取方法(Trizol-氯仿法)，大大提高了操作便捷性和RNA提取效率。此外，本试剂盒将RNA逆转录试剂和PCR反应试剂整合为反应液A和反应液B，使用简单，操作方便，极大的提高了工作效率，方便在临床实践中推广应用。具体实施方式一种用于检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试剂盒，试剂盒内包括A盒和B盒。A盒内设有吸附柱、收集管、裂解液、洗液、洗脱液，B盒内设有阳性对照、阴性对照、RT-PCR反应液A、RT-PCR反应液B。所述RT-PCR反应液B中有2对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增H7N9禽流感病毒HA和NA基因片段，探针分别用于识本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT‑PCR试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有吸附柱、收集管、裂解液、洗液和洗脱液，B盒含有阳性对照、阴性对照、RT‑PCR反应液A和RT‑PCR反应液B；所述RT‑PCR反应液B中有2对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增H7N9禽流感病毒HA和NA基因片段，探针分别用于识别H7N9病毒HA基因、H7N9变异毒株HA基因和H7N9病毒的NA基因。
【技术特征摘要】
1.一种检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有吸附柱、收集管、裂解液、洗液和洗脱液，B盒含有阳性对照、阴性对照、RT-PCR反应液A和RT-PCR反应液B；所述RT-PCR反应液B中有2对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增H7N9禽流感病毒HA和NA基因片段，探针分别用于识别H7N9病毒HA基因、H7N9变异毒株HA基因和H7N9病毒的NA基因。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中用于检测H7N9病毒HA基因的引物对及其MGB探针序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’H7-P：5’-ROX-ACATAGATAGCAGGGC-BHQ2-MGB-3’ROX为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团；...
【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，任宝红，苗银萍，王军，曾小宇，李伟豪，杨会锁，籍玉川，赵林萍，余清卫，
申请(专利权)人：郑州中道生物技术有限公司，中国人民解放军北京军区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：河南,41
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