一种确定靶生物分子中的序列变异的方法，包括： ａ）通过使所述靶生物分子与一种或多种特异性裂解试剂接触将所述靶生物分子裂解成片段； ｂ）用相同的裂解试剂将参比生物分子裂解或模拟裂解成片段； ｃ）确定在ａ）和ｂ）中产生的所述片段的质量信号； ｄ）确定在ａ）中产生的所述片段和在ｂ）中产生的所述片段之间的质量信号的差异；以及 ｅ）根据所述质量信号差异确定经过精简的一组序列变异候选，从而与所述参比生物分子比较确定所述靶中的序列变异。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本专利技术要求于2002年11月27日提交的美国临时申请第60/429,895号、题为“Fragmentation-based Methods and Systems forSequence Variation detection and Discocery”的优选权的好处。与本申请有关还有2003年4月25日提交的美国临时申请第60/466,006号，题目为“Fragmentation-based Methods and Systems forde novo Sequencing”，以及2003年11月26日提交的美国申请，题目为“Fragmentation-based Methods and Systems for SequenceVariation Detection and Discovery”，备案号(attorney docket)24736-2073。在允许的情况下，上述各个申请和临时申请的内容以引用方式结合于本文。
技术介绍
所有生物机体(例如，动物、植物、以及微生物)的遗传信息都编码在脱氧核糖核酸(DNA)中。在人体中，完整的基因组包括约100,000个位于24条染色体上的基因(The Human Genome，T.Strachan，BIOS Scientific Publishers，1992)。针对特定蛋白质的各个基因密码在经过转录和翻译进行表达以后，在活细胞内实现特定的生化功能。遗传密码的变化或变异可导致mRNA的序列或表达水平的变化，并潜在地导致由mRNA编码的蛋白质的变化。这些变化，称为多态性或突变，可能对mRNA或蛋白质的生物活性具有显著的有害效应，从而导致疾病。突变包括核苷酸缺失、插入、取代、或其他变更(即，点突变)。已知有许多种由遗传多态性引起的疾病，包括血友病、地中海贫血症、迪谢内肌营养不良(DMD)、亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病、以及囊性纤维化(CF)(Human Genome Mutations，D.N.Cooper and M.Krawczak，BIOS Publishers，1993)。诸如这些的遗传疾病可起因于在形成特定基因的脱氧核糖核酸(DNA)中单核苷酸的单个添加、取代、或缺失。除导致遗传疾病的突变基因以外，某些先天缺陷是染色体异常的结果，如21三体综合征(唐氏综合征)、13三体综合征(帕陶综合征)、18三体综合征(爱德华兹综合征)、单体性X综合征(特纳综合征)，以及其他性染色体非整倍性的结果，如克兰费尔特综合征(XXY)。另外，不断有证据表明，某些DNA序列可以使个体易患若干疾病中的任何疾病，如糖尿病、动脉硬化、肥胖症、各种自身免疫病、以及癌症(例如，结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌)。在相同物种(例如，人类)的一个以上个体的基因组之间的单核苷酸的改变，是个体之间产生可遗传变异的原因，被称为“单核苷酸多态性”或“SNP”。并不是所有SNP都会导致疾病。根据SNP发生的位置和频率，其效应可以在无害与致死之间变化。某些多态性被认为使某些个体易患疾病，或与某些疾病的发病水平有关。动脉粥样硬化、肥胖症、糖尿病、自身免疫病、以及癌症是几种被认为与多态性有关的疾病。除与疾病有关以外，多态性还被认为在患者对治疗疾病的治疗药剂的反应中起作用。例如，多态性被认为在患者对药物、放射治疗、以及其他形式的治疗的反应能力中起作用。鉴定多态性可更好地了解特定的疾病，并有可能更有效地治疗这类疾病。实际上，基于对患者鉴定出来的多态性而制定的个体化治疗方案可产生挽救性命的药物干涉。一旦鉴定并分离了多态性，则可以发现与特定多态性的产物相互作用的新型药物或化合物。基于多态性也可以实现传染性生物的鉴定，包括病毒、细菌、朊病毒、以及真菌，并且可以向被感染宿主实施适当的治疗反应。因为约16个核苷酸的序列在统计基础上即使对于人体基因组的大小来说也是特定的，所以相对较短的核酸序列可以用来检测高等生物的正常和缺陷型基因，以及检测传染性微生物(例如，细菌、真菌、原生生物、以及酵母菌)和病毒。DNA序列甚至可以用作指纹图谱来检测相同物种内的不同个体(参见，Thompson，J.S.andM.W.Thompson，eds.，Genetics in Medicine，W.B. Saunders Co.，Philadelphia，PA(1991))。使用了多种检测DNA的方法。例如，通过以下方法来鉴定核酸序列通过凝胶电泳，或通过和与待鉴定的序列互补的探针杂交，将扩增核酸分子的迁移率与已知标准进行比较。然而，只有当核酸分子被标记具有敏感报道功能时(例如，放射性的(32P、35S)、荧光的、或化学发光的)才能完成鉴定。放射性标记可能是危险的，并且它们产生的信号随时间衰减。当使用高强度激光时，非同位素标记(例如，荧光的)缺乏敏感性，并且信号会衰减。另外，进行标记、电泳、以及其后的检测是费力、费时、以及易错的操作。电泳尤其容易出错，这是因为核酸分子的大小或分子量无法与在凝胶基质中的迁移率直接相关。已经知道，序列的特异性效应、二级结构、以及与凝胶基质的相互作用会产生人工产物。此外，通过凝胶电泳获得的分子量信息是相关参数(如在凝胶基质中的迁移率)间接测量的结果。质谱测定法在生物科学中的应用已有报道(参见Meth.Enzymol.，Vol.193，Mass Spectrometry(McCloskey，ed.；AcademicPress，NY 1990)；McLaffeetal.，Acc.Chem.Res.27297-386(1994)；Chait and Kent，Science2571885-1894(1992)；Siuzdak，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA9111290-11297(1994))，包括生物聚合物的质谱分析法(参见Hillenkamp et al.(1991)Anal.Chem.631193A-1202A)以及制备和分析生物聚合物梯的方法(参见International Publ.WO 96/36732；美国专利第5,792,664号)。MALDI-MS要求将待分析的大分子结合在基质中，并且已经对多肽和混合在固态(即，晶态)基质中的核酸进行了MALDI-MS。在这些方法中，使用激光撞击在探针端部结晶的生物聚合物/基质混合物，从而实现生物聚合物的解吸和电离。此外，已经利用结晶水(即冰)或甘油作为基质对多肽进行了MALDI-MS。当结晶水被用作基质时，在进行MALDI-MS之前必须首先冻干或风干蛋白质(Berkenkampetal.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA937003-7007)。此方法的质量上限据报道是30kDa，并具有有限的敏感性(即，至少需要10pmol蛋白质)。MALDI-TOF质谱测定法已和传统桑格测序或类似基于引物-扩展的方法一起采用以获得序列信息，包括检测SNP(参见，例如，美国专利第5,547,835、6,194,144、6,225,450、5,691,141、以及6,238,871号；H. Koster et al.，Nature Biotechnol，141123-1128，1996；WO 96/29431；WO 98本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：迪尔克·范登博姆，塞巴斯蒂安·伯克尔，
申请(专利权)人：斯昆诺有限公司，
类型：发明
国别省市：
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