人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段及其载体疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段及其载体疫苗；该免疫原性肽段的氨基酸序列选自SEQ ID No.1～15中的15条序列；该载体疫苗包括与免疫原性载体连接的至少一种上述免疫原性肽段。本发明专利技术设计出了针对PCSK9的15条肽段，并通过验证出这些肽段能有效诱导PCSK9抗体产生并降低总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇的效应。PCSK9免疫原性载体疫苗能降低小鼠的总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇，因此，此类载体疫苗可以应用于制备治疗高脂血症药物。

Human proprotein convertase subtilisin / Kexin 9 immunogenic peptides and vector vaccine

The invention discloses a proprotein convertase subtilisin / Kexin type 9 vaccine immunogenic peptide and its carrier; the amino acid sequence of ID No.1 from SEQ to the immunogenic peptide 15 sequences in 15; the vaccine including immunogenic carrier is connected with at least one of the immunogen peptides. The invention designs 15 peptides for PCSK9, and proves that these peptides can effectively induce the production of PCSK9 antibody and reduce the effect of total cholesterol and low density lipoprotein cholesterol. PCSK9 immunogenicity carrier vaccine can reduce the total cholesterol and LDL cholesterol of mice. Therefore, such vector vaccine can be applied to the preparation of drugs for treatment of hyperlipidemia.

【技术实现步骤摘要】
人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段及其载体疫苗
本专利技术涉及生物
，具体地指一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段及其载体疫苗。
技术介绍
低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)或总胆固醇(TC)升高是引起动脉粥样硬化性心血管病的重要危险因素，人群血清胆固醇水平的升高将导致2010年-2030年期间中国心血管病事件约增加920万，降低人群胆固醇水平非常重要，他汀被推荐为主要降低胆固醇的药物。虽然他汀类药物能有效降低低密度脂蛋白胆固醇和心血管事件，他汀联合胆固醇吸收抑制剂治疗对于降脂达标和减少心血管事件也展现出光明前景，但他汀类降脂药仍存在不足：1)高危患者接受最大剂量他汀治疗后仍存在较高的心血管风险，在PROVE-IT研究中，强化他汀治疗患者仍有较大的心血管残余风险，在2年中发生风险达22.4％；2)家族性高胆固醇血症患者LDL-C显著升高50％患者服用最大剂量的最强效他汀后LDL-C未达标；3)他汀的副作用(如肌痛和横纹肌溶解)使得部分患者不能耐受他汀治疗；4)Meta分析显示，强化剂量他汀治疗会增加新发糖尿病的发生率，限制了最大剂量他汀的使用；5)他汀给药周期短、频次高、病人依从性差。考虑到心血管病治疗的经济负担及他汀治疗的不足，我们需要进一步探索安全有效地降脂且预防心血管疾病的新型治疗药。近年来，前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)作为降低胆固醇治疗新靶点已经得到公认。PCSK9基因是近年发现与血脂代谢密切相关的基因。人群中存在两种突变：功能获得型可导致常染色体显性的家族性高胆固醇血症，与早发心血管病密切相关；功能缺失型可出现低水平的血浆LDL-C和载脂蛋白B，与心血管事件减少密切相关。PCSK9主要通过降解低密度脂蛋白胆固醇受体(LDL-R)，升高LDL-C水平，引起高胆固醇血症。人类PCSK9分子成为高胆固醇血症和心血管病防治的重要靶标。目前针对PCSK9分子的单克隆抗体药物(安进的alirocumab和赛诺菲的evolocumab)在临床试验中显示出强效的降低LDL-C作用，已在美国批准上市。PCSK9单克隆抗体通过结合PCSK9酶，抑制该酶降解LDL-R，发挥降低LDL-C作用。高脂血症及动脉粥样硬化性心血管病需要长期治疗，由于前蛋白转化酶枯草溶菌素9单抗价格极为昂贵，极大制约了其临床应用。同时，单克隆抗体药物也存在随时间药效衰减、高免疫原性(产生抗抗体)等缺陷，使得临床应用受限。这些原因导致了制药巨头辉瑞公司终止极富有前景的PCSK9抑制性单克隆抗体bococizumab的全球开发。因此，开展新的前蛋白转化酶枯草溶菌素9抑制剂如疫苗研究很有必要，疫苗给药剂量小，制备成本低，药品经济负担降低，作用持续时间长，可用于高脂血症及动脉粥样硬化性心血管病的长期治疗。选择合适的靶点和载体是高脂血症等治疗性疫苗研制成功的关键，可选择的靶点理论上有前蛋白转化酶枯草溶菌素9与低密度脂蛋白受体相互结合区域或影响两者结合的所有氨基酸序列。PCSK9结构区域可分为：N端前结构域、催化结构域及C端V结构域。前结构域主要阻断PCSK9的激活及PCSK9与LDLR的结合，催化结构域主要发挥PCSK9对LDLR的降解作用，为主要功能区，C端V结构域的研究数据有限，多数认为对PCSK9与LDLR的结合无明显影响，但新近的研究发现，C端V结构域也参与结合LDLR，且影响PCSK9降解LDLR。因此，PCSK9靶点肽段的选择以催化结构域为主，同时适当兼顾前结构域及V结构域。目前已在我国申请专利的几项PCSK9降脂疫苗(专利申请号：201080049440.6，201280044571.4，201380040051.0、201510017173.9、201510017534.X和201580015813.0)，所选择靶点肽段均来自于催化结构域，且集中于PCSK9催化域起始段(150-170)及中间段(205-225)。但是，上述肽段降脂疫苗也存在一些弊端：1、肽段序列普遍偏长，空间构象变得复杂，这不仅会导致肽段与载体耦联难度增加，且会使耦联率下降，影响疫苗免疫应答效应；2、肽段序列过长，所产生的抗体就更为多样，抗体特异性差，针对治疗靶点的精确性差，也会导致疫苗效果大打折扣，这也是目前尚无类似疫苗上市的重要原因之一；3、肽段序列过长会激活T细胞，可能诱导Th1和杀伤性CD8+T细胞激活，导致自身免疫性损害，这在阿尔茨海默病等慢性疾病疫苗的研制过程中得到印证。在对降脂疫苗的研究过程中；上述专利中的肽段在耦联载体时难度普遍增高，动物体系中抗体效价普遍不高，且降脂效果有限，直接制约降脂疫苗的临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是针对现有短肽的缺陷，提供了一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段，其基于分析PCSK9的结构布局及功能特征，筛选PCSK9的三大结构域，从而优化筛选了一段既针对PCSK9前结构域又针对催化结构域的肽段，其利于耦联或嵌合，靶向性更强，以提高效应能力，且最大程度减少自身免疫性损害的可能。本专利技术还提供了一种载体疫苗，该载体疫苗是由肽段与疫苗载体Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白经过化学耦联制备而成，其应用于高脂血症的治疗。为实现上述第一目的，本专利技术提供的一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段，所述人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段的氨基酸序列选自SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13、SEQIDNo.14和SEQIDNo.15。优选地，所述人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段的氨基酸序列选自SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4和SEQIDNo.5。为了筛选更短的更精确的短肽序列，本专利技术立足于PCSK9的结构及序列特征，综合现有筛选技术及本研究团队专利技术的筛选技术，筛选了15段短肽，每个短肽的序列长度以7-10个氨基酸为宜，虽然短肽序列主要分布在PCSK9的催化结构域，但在前结构域及C端V结构域也有分布。最终，筛选出5段短肽，其中一段短肽跨越前结构域及催化结构域起始部分，既能抑制PCSK9的催化活性，又能抑制PCSK9催化活性的转换，是现有专利所不具备的特征。本专利技术的第二个目的是提供了一种载体疫苗，其包括与免疫原性载体连接的至少一种上述免疫原性肽段。优选地，所述免疫原性肽段选自SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4和SEQIDNo.5。优选地，所述免疫原性载体为Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白或钥孔血蓝蛋白。本专利技术还提供了一种上述载体疫苗在制备治疗高脂血症药物中的应用。本专利技术还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求3～4中任一项的载体疫苗和药物可接受的佐剂。所述佐剂为氢氧化铝。本专利技术的有益效果在于：1、根据PCSK9的氨基酸序列、亲水性、抗原性、可及性等特性，综合生物信息学、药理学方法，本专利技术设计出了针对PCSK9的15条肽段，并通过验证出这些肽段能有效诱导PCSK9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段，其特征在于：所述人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段的氨基酸序列选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和SEQ ID No.15。

【技术特征摘要】
1.一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段，其特征在于：所述人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段的氨基酸序列选自SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13、SEQIDNo.14和SEQIDNo.15。2.根据权利要求1所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段，其特征在于：所述人前蛋白转化酶枯草溶菌素9免疫原性肽段的氨基酸序列选自SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱志华，廖玉华，潘雅杰，陈霄，
申请(专利权)人：邱志华，
类型：发明
国别省市：湖北,42