基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法，所述的检测试剂盒包含一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物；其通过检测与脑卒中相关的亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化程度辅助诊断脑卒中，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于脑卒中的早期发现和及时治疗。

【技术实现步骤摘要】
基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及脑卒中的辅助诊断
，特别涉及基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法，尤其指一种能用于检测与脑卒中相关的亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
脑卒中(cerebralstroke)是一组以脑部缺血及出血性损伤症状为主要临床表现的疾病，又称脑中风或脑血管意外，具有极高的病死率和致残率，主要分为出血性脑中风(脑出血或蛛网膜下腔出血)和缺血性脑中风(脑梗塞、脑血栓形成)两大类，以脑梗塞最为常见。该病发病急，病死率高，临床表现为严重头痛、昏厥、呕吐、眩晕、失去意识等，是世界上最重要的致死性疾病之一。这也成为了中国成年人残疾的首要原因。脑卒中患者需要长期服用降压药，定期进行常规检查，控制颅内压，可见脑卒中患者给社会和家庭带来了极大的经济负担。且中风的死亡率也有随着年龄增长而增加的趋势，由于对脑卒中的发病机制仍不是十分明确，因此对脑卒中患者的预防刻不容缓。亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolatedehydrogenase1，MTHFD1)是一种蛋白编码基因，它是叶酸和组氨酸代谢的一个关键酶，叶酸参与氨基酸的代谢，在甘氨酸与丝氨酸、谷氨酸和组氨酸、同型半胱氨酸和蛋氨酸的相互转化之间都充当了一碳单位的载体。亚甲基四氢叶酸脱氢酶1是由位于14号染色体的亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因(adenosylhomocysteinasegene，MTHFD1)(Chr14:64855140—64855216)编码而成的。现在国内外的研究已经确定同型半胱氨酸水平与脑卒中的发生有着较大的关联，但是对同型半胱氨酸水平的影响因素与其调控机制的研究仍然较少。根据目前研究，国内外还未设计出任何用于检测与脑卒中相关的亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便、普适性高、针对性强、检测准确率高的辅助诊断脑卒中的检测试剂盒；通过对样品指定基因启动子区域DNA甲基化水平测定辅助诊断脑卒中，检测方法简单、无创、检测效率高。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：5’-AAGGTTATGGCGTTAGTAGAA-3’；所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：5’-CCACACTCAACAACAATATCAA-3’。基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：步骤一、提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；步骤二、采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；步骤三、荧光定量实时特异性PCR前期准备：准备qMSP所需物质包括水、酶、引物、模板；步骤四、进行荧光定量实时特异性PCR：取步骤二中转化过的DNA样本加入到ZymoTaqTMPreMix酶，并加入一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增；步骤五、对结果进行甲基化程度分析。为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：所述的步骤一中采用Lab-Aid820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。所述的步骤二中采用EZDNAMethylation-Gold试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。所述的步骤四中PCR扩增条件为：首先95℃10min的预变性；接着95℃20s，Tm20s，72℃30s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应40℃10min。本专利技术基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法，所述的检测试剂盒包含一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物；通过检测与脑卒中相关的亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化程度辅助诊断脑卒中，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于脑卒中的早期发现和及时治疗。其具有以下优点：1）准确、高效本产品采用实时荧光定量PCR技术，能够进行实时监测，特异性强，具有较高的精确度。2）方便、快捷本产品是基于血浆、唾液、尿液等体液检查设计的试剂盒，便于及时得到样本送检，且能在较短时间内取得诊断结果。3）舒适、安全本产品采用非侵入式检测，告别入侵式的痛苦。同时，在检测过程中，对人体不存在任何的隐性或者显性的危险。4)经济、节约本产品相较于已有的诊断方式仅需较低的经济费用，能够普及给大多数人群。5）普适、认同本产品的检测方法，能够为广大的民众所接受，不存在伦理问题。附图说明图1是被检片段长度以及CpG位点的相关性示意图；图2是深圳地区病例组与对照组间的比较表图(表1)；图3是宁波地区病例组与对照组间的比较表图(表2)；图4是深圳与宁波地区病例组间的比较表图(表3)；图5是深圳与宁波地区对照组间的比较表图(表4)。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：5’-AAGGTTATGGCGTTAGTAGAA-3’；所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：5’-CCACACTCAACAACAATATCAA-3’。基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：步骤一、提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；采用Lab-Aid820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度；全血基因组DNA来自于被检测者的血浆、唾液、尿液等体液。步骤二、采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；全基因组DNA中的胞嘧啶(C)与亚硫酸氢盐反应会使游离的未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶(T)，而已发生甲基化的胞嘧啶则保持不变。根据这一原理，通过使用ZymoResearch公司的EZDNAMethylation-Gold试剂盒，经上样、洗涤、洗脱、PCR等步骤得到转化后的DNA。步骤三、荧光定量实时特异性PCR前期准备：准备qMSP所需物质包括水、酶、引物、模板；其中，基因启动子区甲基化特异性扩增引物(含有上游引物和下游引物)已包括在本专利技术检测试剂盒之中，而引物在加样之前则需用PrimerTE或ddH2O进行稀释。步骤四、进行荧光定量实时特异性PCR(qMSP)：取步骤二中转化过的DNA样本加入到ZymoTaqTMPreMix酶，并加本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒包含一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：5’‑ AAGGTTATGGCGTTAGTAGAA ‑3’；所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：5’‑ CCACACTCAACAACAATATCAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒包含一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：5’-AAGGTTATGGCGTTAGTAGAA-3’；所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：5’-CCACACTCAACAACAATATCAA-3’。2.根据权利要求1所述的基于MTHFD1甲基化辅助诊断脑卒中的检测试剂盒的检测方法：其特征是：包括以下步骤：步骤一、提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；步骤二、采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；步骤三、荧光定量实时特异性PCR前期准备：准备qMSP所需物质包括水、酶、引物、模板；步骤四、进行荧光定量实时特异性PCR：取步骤二中...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩丽媛，季慧慧，段东辉，许国栋，段世伟，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33