一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于7‑硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法，将中间体4‑氨基‑7‑硝基苯并呋咱与三乙胺混合于二氯甲烷溶液中，冰浴条件下滴加含丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，之后进行反应，反应产物经过后续处理得到谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针。该荧光探针用于环境或生物样品中的谷胱甘肽和半胱氨酸的荧光传感分析。通过荧光分光光度计研究了探针MP1在DMSO/PBS(10 mM,pH=7.4,1/9,v/v)溶液体系中与各类氨基酸的识别特性。结果表明：探针MP1对谷胱甘肽和半胱氨酸的选择性好，抗干扰能力强，可以灵敏快速的从多种氨基酸中区分出谷胱甘肽和半胱氨酸，具有很好的应用前景。

A glutathione and cysteine fluorescent probe and preparation method of 7 furazan based on nitrobenzene

The invention discloses a glutathione and cysteine fluorescent probe and preparation method of 7 nitrobenzene furazan based on the intermediate 4 nitrobenzene and 7 amino furazan and three triethylamine mixed in dichloromethane solution, under the condition of ice bath adding dichloromethane solution containing acryloyl chloride, after the reaction, the reaction product after the subsequent processing glutathione and cysteine fluorescent probe. The fluorescence probe is used for fluorescence sensing analysis of glutathione and cysteine in environmental or biological samples. On the MP1 in the DMSO/ PBS probe by fluorescence spectrophotometry (10 mM, pH=7.4,1/9, v/v) solution with various amino acid recognition properties. The results showed that the probe MP1 has good selectivity for glutathione and cysteine, and has strong anti-interference ability. It can sensitively and quickly separate glutathione and cysteine from many kinds of amino acids. It has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法
本专利技术涉及一种用于谷胱甘肽和半胱氨酸荧光识别的新型检测剂，具体涉及一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针分子的制备方法与应用。
技术介绍
在生物体中，生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸(Cys)等在生理过程如细胞代谢过程和维持氧化还原反应平衡等过程中发挥着重要的作用。细胞内该类硫醇含量的变化会引起一系列的疾病，如艾滋病、水肿、冠心病、帕金森症、癌症和牛皮癣等。作为细胞内含量最高的非蛋白质硫醇，谷胱甘肽(GSH)在保持氧化还原动态平衡过程中发挥着非常重要的作用，其含量的过高或者过低则与癌症等许多疾病有着直接的关系。生物体内半胱氨酸(Cys)的缺乏会引起一系列病症，如皮肤损伤，肝脏水肿等病症。因此，快速实时监测该类硫醇在生物体内的含量在临床医学和生物化学中有着重要的意义。荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简便快速、对检测物损伤少等优点已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。荧光探针分子的开发与利用研究是化学与生物、医学、农业等科学的交叉领域。荧光探针技术是在分子水平上对研究对象进行研究的分析方法。荧光探针目前已经被广泛应用于环境和生物体中重金属、生物活性小分子等物质的检测。荧光探针法因其具有操作简单，专一高效的选择性已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。相比于生物体内常见的其他氨基酸，生物硫醇如半胱氨酸(Cys)，谷胱甘肽(GSH)分子结构中都含有巯基，因此对生物硫醇的检测可以通过对巯基的识别来实现。巯基具备较强的亲核性，目前已报道的很多硫醇荧光探针主要是利用其较强的亲核性来实现对生物硫醇的高效识别。
技术实现思路
本专利技术提出了一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法，合成的荧光探针能够灵敏快速的从多种氨基酸中区分出谷胱甘肽和半胱氨酸。实现本专利技术的技术方案是：一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针（记作MP1），所述荧光探针分子的结构式如下：。所述的基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针的制备方法，步骤如下：避光条件下，将中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱（NBD-NH2）与三乙胺混合于二氯甲烷溶液中，冰浴条件下滴加含丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应后，反应液用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和正己烷为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到浅黄色固体，得到谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针。所述步骤（1）中，避光条件为采用锡箔纸包裹反应容器。所述步骤中三乙胺为缚酸剂，中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱与三乙胺的摩尔比为1：（2-10），所用二氯甲烷需经无水处理，所述冰浴反应温度为0℃，反应时间为3-12小时。所述中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱与丙烯酰氯的摩尔比为1：（2-5）。所述硅胶柱分离的洗脱液为乙酸乙酯和正己烷，所述乙酸乙酯与正己烷的体积比为1：（5-20）。所述中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱的制备方法为：避光条件下，将氨水溶液逐滴滴加到含有4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液中，所述4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液的浓度为40-70%，室温下搅拌反应20-30小时，减压蒸馏得到固体，所述固体用乙酸乙酯溶解，以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄褐色固体，所述黄褐色固体为中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱。所述4-氯-7-硝基苯呋咱与氨水溶液的物质的量之比为1:（15-30）。基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针在检测谷胱甘肽和半胱氨酸中的应用。所述二氯甲烷无水处理的方法为：向二氯甲烷中加入氢化钙回流2-4小时后蒸馏，即得无水的二氯甲烷。本专利技术中制备荧光探针MP1的过程中所使用的化学试剂、溶剂、金属盐等均购自国药集团化学试剂有限公司。在荧光探针MP1的确证和性能测试过程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振谱仪，溶剂为氘代氯仿，以TMS为内标记录核磁共振氢谱和碳谱。采用Thermo公司的Q-ExactiveHR-MS质谱仪记录高分辨质谱数据。采用日本日立公司F-7000荧光光谱仪记录荧光光谱。本专利技术的具体合成路线如下：本专利技术的有益效果是：通过简单的一步反应得到荧光探针，合成路线短，方法简便，产率高。荧光探针在DMSO/PBS(10mM,pH=7.4,1/9,v/v)溶液体系中对谷胱甘肽和半胱氨酸的选择性好，抗干扰能力强，可以灵敏快速的从多种氨基酸中区分出谷胱甘肽和半胱氨酸。荧光探针结构中的荧光团4-氨基-7-硝基苯并呋咱具有较长的发射波长和良好的细胞通透性，有利于该类探针在生物体内识别谷胱甘肽和半胱氨酸，因此具有较好的应用前景。附图说明图1为本专利技术的荧光探针MP1荧光选择性图，激发波长380nm。图2为本专利技术的荧光探针MP1识别GSH的竞争性实验图，激发波长380nm，发射波长500nm。图3为本专利技术的荧光探针MP1识别Cys的竞争性实验图，激发波长380nm，发射波长500nm。图4为本专利技术的荧光探针MP1荧光动力学实验图，激发波长380nm，发射波长500nm。图5为本专利技术的荧光探针MP1识别GSH的荧光滴定图，插图为最低检测限图，激发波长380nm，发射波长500nm。图6为本专利技术的荧光探针MP1识别Cys的荧光滴定图，插图为最低检测限图，激发波长380nm，发射波长500nm。图7为本专利技术的荧光探针MP1识别GSH和Cys的酸碱度实验图，激发波长380nm，发射波长500nm。具体实施方式实施例1荧光探针的合成：（1）避光条件下，将氨水溶液逐滴滴加到含有4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液中，所述4-氯-7-硝基苯呋咱与氨水溶液的物质的量之比为1:15，所述4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液的浓度为40%，室温下搅拌反应20小时，减压蒸馏得到固体，所述固体用乙酸乙酯溶解，以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄褐色固体，所述黄褐色固体为中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱；（2）避光条件下，将中间体NBD-NH2(180mg,1mmol)与三乙胺(270μL,2mmol)混合于15mL二氯甲烷溶液中，冰浴条件下滴加入丙烯酰氯(162μL,2mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，冰浴条件下反应完全后(3小时)，反应液用饱和氯化钠溶液(15mL*3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和正己烷为洗脱剂（体积比为1:6），经硅胶柱层析分离得到105.3mg的浅黄色固体，即为荧光探针分子，产率为45%。核磁共振氢谱测定：1HNMR(400MHz,DMSO,ppm)δ:5.97(dd,1H,J=1.6Hz),6.46(dd,1H,J=1.6Hz),6.93(t,1H,J=9.0Hz),8.51(d,1H,J=8.0Hz),8.79(d,1H,J=8.4Hz),11.62(s,1H)。核磁共振碳谱测定：13CNMR(100MHz,DMSO,ppm)δ:114.7,130.6,130.8,131.0,135.1,136.2,143.9,146.1,165.5。高分辨质谱测定：HR-MSm/z:理论值：C9H7N4O4([M+H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于7‑硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针，其特征在于，所述荧光探针分子的结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针，其特征在于，所述荧光探针分子的结构式如下：。2.如权利1要求所述的基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于步骤如下：避光条件下，将中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱与三乙胺混合于二氯甲烷溶液中，冰浴条件下滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应后，反应液用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和正己烷为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到浅黄色固体，得到谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针。3.如权利要求2所述的基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，避光条件为采用锡箔纸包裹反应容器。4.如权利要求2所述的基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：所述中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱与三乙胺的摩尔比为1：（2-10），所用二氯甲烷需经无水处理，所述冰浴反应温度为0℃，反应时间为3-12小时。5.如权利要求2所述的基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马志伟，刘俊桃，侯学会，刘志景，吕全建，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：河南,41