一种pH荧光探针的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种pH荧光探针的制备方法及其应用，设计了新型荧光探针CM‑BHNBD，它是源自NBD(4‑硝基苯‑2‑乙二酸‑1 3‑二咗)，能够对荧光团的细胞内线粒体/膜内酸化监控，应用于生物样本体内pH检测，具有响应性好、数据的准确性、重现性、精密度高等优点，可实施性强。

Preparation method and application of pH fluorescent probe

The present invention provides a method for the preparation and application of pH fluorescent probe, designed a new type of fluorescent probe CM BHNBD, which is derived from NBD (4 nitrobenzene 2 3 two oxalic acid 1, to the) fluorophore mitochondria / membrane acidification monitoring, detection in biological samples the body of pH, has good responsiveness, data accuracy, repeatability, high precision, strong operability.

【技术实现步骤摘要】
一种pH荧光探针的制备方法及其应用
本专利技术属于分析化学领域，涉及一种pH荧光探针的制备方法及其用于生物样本内针对pH值的实时检测方法，具体为细胞内线粒体或线粒体膜内酸化监控。
技术介绍
目前，对细胞内线粒体/膜内H+监控的分析，化学方法主要包括高效液相色谱与质谱、气相、紫外检测器等，荧光分子探针检测方法数量非常少。气相色谱检测方法已经在很多领域得以应用，但对于分析领域以及临床医学生物样本的快速检测来说并不是最好的选择，首先，气相色谱检测方法技术步骤复杂，样品处理步骤繁多、工作量大、操作时间长、效率低下等。这对于医学生物样本，特别是活细胞、活体检测是完全没有可能实现的。其次，样品需求量大，试剂消耗量大。生物样本的特点在于样本量微小，而色谱联合大型仪器检测的方法则往往需要预处理较大数量的待测样本来达到目标物纯化、富集、分离的目的，因此并不适用于微量样本分析。最后，大型仪器本身成本高，且操作往往步骤缜密，不易于掌握和推广，在高效率快节奏的现代社会，此类方法的应用似乎达到了发展的瓶颈期。荧光分子探针检测主要通过设计荧光分子探针对待测物进行高度选择检测，从而产生荧光响应的改变，并利用光学信号的差异性质来对待测物进行高灵敏检测。步骤大体概括为：分子设计、样品检测等。基于荧光分子探针的检测与应用是分析技术中比较新颖的技术，其原理在于通过分子设计思想，将发光基团与反应基团连接得到分子探针。检测时，探针通过反应基团的特异性反应来识别目标物，分子结构的改变将对发光基团造成影响，使荧光信号发生改变，从而实现对目标物的检测或生物成像。从其检测原理可见此类方法优势在于选择性好，不需要待测物分离，操作简便，适于样品的批量分析。所以该方法在生命分析研究领域备受推崇。目前，生命有机分析检测领域中涌现出很多快捷方便的检测手段，包括比色法、肉眼监测等等。这些方法已在细胞分析、活体监测等领域广为使用，但对活细胞内pH的检测却依然处于研究的空白。因此，将检测方法进一步改善，将实验操作的便捷程度继续提高是活细胞内pH检测方法开发的实际需求。pH值在细胞自噬和细胞凋亡以及胃食道疾病中扮演着重要的生理和病理的角色。然而,最新的证据表明,细胞内酸化是集中反映细胞内组织病变的主要标志。虽然目前已经调查了较多的异常细胞酸化,但是仍需要更进一步的地阐述多种生物效应与多个刺激细胞内冲突环境下的细胞酸化。此外,目前医学对肠粘膜内酸化监测和经药物筛选的胃肠病非常紧迫。pH值在细胞机能方面扮演重要角色，细胞代谢，维持生命。在正常情况下，适当的酸度可以调节酶的活性，促进蛋白质的降解，从而为代谢循环营造有利的环境。然而，pH值异常变化，如酸化，会发生与细胞自噬过程相关的细胞功能障碍，细胞凋亡和细胞器的损害。例如，线粒体中起着核心作用，决定细胞分化和细胞周期的增长，而线粒体酸化有牵连的线粒体自噬，去极化，和各种疾病，包括心血管疾病、神经病变和癌症。因此，细胞或组织酸化总是意味着体内严重损伤的发生。因此，细胞或组织酸化总是意味着体内严重损伤的发生。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述问题，提供一种pH荧光探针的制备方法，本专利技术研究设计了新型荧光探针BHNBD和CM-BHNBD，它们是源自NBD(4-硝基苯-2-乙二酸-13-二咗)，能够对荧光团的细胞内线粒体/膜内酸化监控，应用于生物样本体内pH检测，具有响应性好、数据的准确性、重现性、精密度高等优点，可实施性强。同时，本专利技术还提供了将上述pH荧光探针应用于生物样本内细胞pH值的实时检测方法。本专利技术技术方案如下：一种PH荧光探针的制备方法，步骤包括：（1）将NBD-Cl(7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole)按照浓度0.001～-0.008g/mL溶解于氯仿中，然后再加入同体积氯仿的溶液，氯仿的溶液为氯仿中含有体积分数0.39～1%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，至沉淀完全析出，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得NBD肼；（2）将氯铬酸吡啶盐加入到二氯甲烷中，加入浓度0.041～0.12g/mL，超声溶解，然后加入浓度0.02～0.08g/mL的4-（氯甲基）苯甲基醇，氮气保护下室温搅拌反应3～4h，反应完成后加入二氯甲烷3～4倍体积的无水乙醚，搅拌5min后静置分层，移除上清液，取下层胶状物，再加前述同体积的无水乙醚，研磨20min，依次用水、5%碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥、旋蒸，得白色晶体；（3）将步骤（2）白色晶体溶解于无水乙醇中，溶解浓度0.002～0.006g/mL，然后加入浓度0.002～0.004g/mL的NBD肼，再滴加无水乙醇体积1%的冰乙酸，加热回流反应3～4h，反应结束后旋蒸除去溶剂，再经硅胶柱纯化、梯度洗脱，得橘红色固体粉末，即PH荧光探针。进一步地，步骤（1）中，所述水合肼-甲醇溶液中，水合肼体积浓度为0.2～1.2%。进一步地，步骤（1）中，所述NBD-Cl按照浓度0.004g/mL溶解于氯仿中。进一步地，步骤（2）中，氯铬酸吡啶盐加入到二氯甲烷中浓度为0.083g/mL，然后加入4-（氯甲基）苯甲基醇的浓度为0.05g/mL。进一步地，步骤（2）中，所述二氯甲烷优选新蒸无水二氯甲烷。进一步地，步骤（2）中，采用点板跟踪反应进程，原料消耗完后即为终点。进一步地，步骤（2）中，所述洗涤，优选依次用水洗三次、5wt%碳酸氢钠洗两次、饱和氯化钠溶液洗一次，每次洗涤液用量为无水乙醚体积的0.5倍。进一步地，步骤（3）中，步骤（2）白色晶体于无水乙醇中溶解浓度为0.004g/mL，然后加入NBD肼的浓度为0.0032g/mL。进一步地，步骤（3）中，所述硅胶柱纯化，优选二氯甲烷溶解；所述梯度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇500：1至200：1。上述本专利技术方法制备得到的PH荧光探针（即CM-BNBD探针）效果判断指标如下：吸收波长改变：pH值从酸性到中性吸收向红光移动近100nm；检测范围：pH1.98～7.00范围内存在线性关系。上述PH荧光分子探针的应用：适用于生物样本中，细胞内线粒体/膜内的pH检测分析、组织粘膜上的pH检测分析，检测灵敏、准确、快捷；所述的生物样本主要包括食管粘膜、胃粘膜、Hela细胞等，可应用于生命有机分析、分析化学、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。一种采用上述PH荧光分子探针用于细胞内线粒体/膜内pH值的实时检测方法，步骤包括：1）配制溶液配制CM-BNBD探针储备液：准确称取PH荧光分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为1×10-4mol/L，得CM-BNBD探针储备液；配制待测目标物缓冲液（Britton-Robison缓冲液）：用0.04mol/L磷酸、硼酸和醋酸配制而成，使用时用0.2mol/L的NaOH水溶液调节至所需pH值；2）建立pH值与荧光信号强度的线性方程取步骤1）配制的待测目标物缓冲液稀释得到梯度浓度的pH值为2～7的缓冲标准品溶液，各取200μL分别与30μLCM-BNBD探针储备液和770μL乙腈，振摇混合均匀，于37℃下放置5min，然后经荧光分光光度计或紫外光谱仪检测，建立pH值与荧光信号强度的线性方程；进一步地，步骤2）中，梯度浓度的缓冲标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PH荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤包括：（1）将NBD‑Cl按照浓度0.001～‑0.008g/mL溶解于氯仿中，然后再加入同体积氯仿的溶液，氯仿的溶液为氯仿中含有体积分数0.39～1%的水合肼‑甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，至沉淀完全析出，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得NBD肼；（2）将氯铬酸吡啶盐加入到二氯甲烷中，加入浓度0.041～0.12g/mL，超声溶解，然后加入浓度0.02～0.08 g/mL的4‑（氯甲基）苯甲基醇，氮气保护下室温搅拌反应3～4 h，反应完成后加入二氯甲烷3～4倍体积的无水乙醚，搅拌5min后静置分层，移除上清液，取下层胶状物，再加前述同体积的无水乙醚，研磨20min，依次用水、5wt%碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥、旋蒸，得白色晶体；（3）将步骤（2）白色晶体溶解于无水乙醇中，溶解浓度0.002～0.006 g/mL，然后加入浓度0.002～0.004g/mL的NBD肼，再滴加无水乙醇体积1%的冰乙酸，加热回流反应3～4h，反应结束后旋蒸除去溶剂，再经硅胶柱纯化、梯度洗脱，得橘红色固体粉末，即PH荧光探针。...

【技术特征摘要】
1.一种PH荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤包括：（1）将NBD-Cl按照浓度0.001～-0.008g/mL溶解于氯仿中，然后再加入同体积氯仿的溶液，氯仿的溶液为氯仿中含有体积分数0.39～1%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，至沉淀完全析出，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得NBD肼；（2）将氯铬酸吡啶盐加入到二氯甲烷中，加入浓度0.041～0.12g/mL，超声溶解，然后加入浓度0.02～0.08g/mL的4-（氯甲基）苯甲基醇，氮气保护下室温搅拌反应3～4h，反应完成后加入二氯甲烷3～4倍体积的无水乙醚，搅拌5min后静置分层，移除上清液，取下层胶状物，再加前述同体积的无水乙醚，研磨20min，依次用水、5wt%碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥、旋蒸，得白色晶体；（3）将步骤（2）白色晶体溶解于无水乙醇中，溶解浓度0.002～0.006g/mL，然后加入浓度0.002～0.004g/mL的NBD肼，再滴加无水乙醇体积1%的冰乙酸，加热回流反应3～4h，反应结束后旋蒸除去溶剂，再经硅胶柱纯化、梯度洗脱，得橘红色固体粉末，即PH荧光探针。2.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述水合肼-甲醇溶液中，水合肼体积浓度为0.2～1.2%；所述NBD-Cl按照浓度0.004g/mL溶解于氯仿中。3.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，氯铬酸吡啶盐加入到二氯甲烷中浓度为0.083g/mL，然后加入4-（氯甲基）苯甲基醇的浓度为0.05g/mL；所述二氯甲烷为新蒸无水二氯甲烷；采用点板跟踪反应进程，原料消耗完后即为终点；所述洗涤，优选依次用水洗三次、5wt%碳酸氢钠洗两次、饱和氯化钠溶液洗一次，每次洗涤液用量为无水乙醚体积的0.5倍。4.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，步骤（2）白色晶体于无水乙醇中溶解浓度为0.004g/mL，然后加入NBD肼的浓度为0.0032g/mL；所述硅胶柱纯化，选用二氯甲烷溶解；所述梯度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇500：1至200：1。5.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于：制备得到的PH荧光探针效果判断指标如下：吸收波长改变：pH值从酸性到...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光，窦昆，付强，李震，姜翱，刘玉霞，尤进茂，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37