一种基于氢离子激活的双响应检测ClO制造技术

本发明专利技术涉及一种基于氢离子激活的双响应检测ClO

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析化学领域，涉及一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的制备方法及应用。
技术介绍
氧化还原平衡活性氧(ROS)和还原硫物种(RSS)在调节生物过程中扮演关键角色,如细胞增殖、分化和细胞凋亡。氧化还原平衡的破坏由于生产过剩的活性氧，压倒细胞的保护防御机制将导致的后果如过氧化反应，DNA损伤，甚至是更有害的结果，如果基因变异影响的正常修复蛋白质改变。作为一个著名的分子RSS、硫化氢(H2S)，已经被证明有抗凋亡和抗炎效果。由于硫化氢对胃黏膜有保护作用，因而，一直在利用新的溃疡性医学的设计，胃肠道炎症和恶性肿瘤疾病。不幸的是，越来越多的人类或者动物患有胃炎、胃粘膜的炎症，由于相对缺乏H2S在胃液和粘膜，在硫化氢被过量的活性氧，如次氯酸盐(ClO-)、过氧化氢(H2O2)，过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等。在病理条件下，特别是过度ClO-由一些病理或通过食物摄取/水通过一个极快的反应会导致显著的低水平的H2S。因此，ClO-的失衡，H2S可能首先导致炎性疾病，然后在DNA损伤的炎症和最后的转换为胃炎症溃疡或癌症。更糟糕的是，在日常生活中，自来水消毒氯引起了ClO-的过度积累，已经导致胃部不适。因此，迫切需要研究氧化还原反应ClO-/H2S在体内或体外对生物体的各种响应。显色和荧光活性氧探针享受优势包括高灵敏度和选择性,分析可视化和方便被广泛设计等生化分析氧化分子ClO-、H2O2等。与此同时,许多复杂的RSS探针设计，与硫化氢、谷胱甘肽等,可以巧妙地检测各种样品像血液、组织、细胞和细胞器。此外,探讨氧化应激产生的ROS/RSS的不平衡,一些双响应探针在生物系统,适时地为氧化还原开发涉及超氧化物阴离子、氢聚硫化物、过氧硝酸盐、谷胱甘肽、过氧化氢、氢硫化物、次溴酸和硫化氢。然而,到目前为止,调查对氧化还原（ClO-/H2S)有响应的仍不发达。除了荧光Se–BODIPY以外，到目前为止还没有对（ClO-/H2S)同时检测的。此外，对于处在胃样品的酸性环境下的ClO-/H2S检测来说，需要的是一种能够在H+存在的条件对ClO-和H2S作出响应的探针。然而，据目前所知还没有探针能在酸性条件下对ClO-/H2S进行检测，这很显然限制了动物体内ClO-和H2S平衡的研究。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述问题，提供一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针（即探针BNBD）的制备方法.制备得到的分子探针可应用于生物样本检测，具有响应性好、数据的准确性、重现性、精密度高等优点，本专利技术还提供了其应用，即采用上述制备得到的分子探针检测胃液和胃粘膜中内源性ClO-和H2S的方法，本专利技术方法可实现对ClO-和H2S的同时检测，设备便捷易操作，可实施性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。本专利技术技术方案如下：一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的制备方法，步骤为：（1）将NBD-Cl(7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole)溶解于氯仿中，溶解浓度0.002~0.012g/mL，然后加入氯仿同体积的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得产物1；（2）将产物1溶于乙醇中，溶解浓度0.01-0.02g/mL，然后分别加入苯甲醛和冰醋酸，加入浓度分别为1mol/L和0.1mol/L，回流3h，冷却，析出红黑色固体，固体用体积比1:1的乙酸乙酯-石油醚洗脱液洗脱，收集第一个产物，烘干得红色固体，即为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针。步骤（1）中，所述的水合肼-甲醇溶液中，水合肼体积浓度为0.2～1.2%。所述的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针效果判断指标如下：检测灵敏度:检测限ClO-为2.7nmol/L、H2S为6.9nmol/L；荧光猝灭倍数均为140倍；检测速度：检测ClO-的速度为50秒;检测H2S速度为10秒；吸收波长改变：检测ClO-时吸收向蓝光移动200nm；检测H2S时吸收向蓝光移动100nm；双通道颜色变化：在日光灯下，接触H+时颜色由黄色变为红色，检测ClO-时颜色由红色变为无色，检测H2S时颜色由红色变为黄色；紫外灯下的颜色在接触H+时由无色变为黄色，检测ClO-和H2S时，颜色均变暗；光学机理指标：在酸性环境下，探针荧光被触发，此时遇待测物后，PET恢复至荧光淬灭，从而实施定量，同时伴随不同程度的吸收蓝移来鉴别两个待测物ClO-和H2S。上述方法制备的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的应用：适用于生物样本中ClO-和H2S的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；其中生物样本主要包括胃液、胃粘膜、细胞等，可应用于分析化学、生命有机分析、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。本专利技术基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针：定量分析生物样本中ClO-和H2S时，适用于同时检测胃液或胃粘膜中的ClO-和H2S的含量；定性分析生物样本中ClO-和H2S时，适用于胃液样品中ClO-和H2S的肉眼监测、胃粘膜组织内ClO-和H2S的监测和活细胞内ClO-和H2S的监测。本专利技术基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针检测胃液和胃粘膜中内源性ClO-和H2S含量的方法，步骤包括：1）配制溶液配制探针BNBD储备液：准确称取基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2×10-4M的探针BNBD储备液；配制待测目标物ClO-储备液：准确称取待测目标物ClO-溶于水中，配制浓度为1×10-3M的ClO-储备液；配制待测目标物H2S储备液：准确称取待测目标物H2S溶于水中，配制浓度为1×10-3M的H2S储备液；配制血清储备液：将空白样品和无水乙腈按体积比5:1混合，处理得血清储备液；步骤1）中，所述的空白样品为人工胃液、离体胃液或离体胃粘膜；所述的人工胃液的制备方法为：取稀盐酸16.4ml，加800ml水和10g胃蛋白酶，摇匀后，加水稀释至1000ml；其中，所述稀盐酸质量浓度为9.5～10.5%。2）制备待测样品溶液取100µL待测样品，加入30µL探针BNBD储备液、100µL浓度为0.2mM、pH1.98的Britton-Robison缓冲液、100µL蒸馏水和670µL乙腈混合均匀，得待测样品溶液；步骤2）中，所述的待测样品为胃粘膜时，胃粘膜先由人工胃液冲洗，刮掉粘膜外的杂质，然后取1mm的薄层，用生理盐水浸泡清洗。3）建立标准品的线性方程ClO-标准品的线性方程：取步骤1）配制的待测目标物ClO-储备液稀，释得到梯度浓度为1～900μM的ClO-标准品溶液，然后分别取100µL稀释后的各浓度ClO-标准品溶液与30µL探针BNBD储备液和770µL血清储备液混合后，再分别加入100µL浓度为0.2mM、pH1.98的Britton-Robison缓冲液，振摇混合均匀，于37℃下放置60min，然后经荧光分光光度计检测，建立血清/ClO-浓度与荧光信号强度的线性方程，即ClO-标准品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于氢离子激活的双响应检测ClO‑/ H2S荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤为：（1）将NBD‑Cl溶解于氯仿中，溶解浓度0.002～0.012 g/mL， 然后加入氯仿同体积的水合肼‑甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得产物1；（2）将产物1溶于乙醇中，溶解浓度0.01～0.02g/mL，然后分别加入苯甲醛和冰醋酸，加入浓度分别为1mol/L和0.1mol/L，回流3h，冷却，析出红黑色固体，固体用体积比1:1的乙酸乙酯‑石油醚洗脱液洗脱，收集第一个产物，烘干得红色固体，即为基于氢离子激活的双响应检测ClO‑/ H2S荧光分子探针。

【技术特征摘要】
1.一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤为：（1）将NBD-Cl溶解于氯仿中，溶解浓度0.002～0.012g/mL，然后加入氯仿同体积的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得产物1；（2）将产物1溶于乙醇中，溶解浓度0.01～0.02g/mL，然后分别加入苯甲醛和冰醋酸，加入浓度分别为1mol/L和0.1mol/L，回流3h，冷却，析出红黑色固体，固体用体积比1:1的乙酸乙酯-石油醚洗脱液洗脱，收集第一个产物，烘干得红色固体，即为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的水合肼-甲醇溶液中，水合肼体积浓度为0.2～1.2%。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针效果判断指标如下：检测灵敏度:检测限ClO-为2.7nmol/L、H2S为6.9nmol/L；荧光猝灭倍数均为140倍；检测速度：检测ClO-的速度为50秒;检测H2S速度为10秒；吸收波长改变：检测ClO-时吸收向蓝光移动200nm；检测H2S时吸收向蓝光移动100nm；双通道颜色变化：在日光灯下，接触H+时颜色由黄色变为红色，检测ClO-时颜色由红色变为无色，检测H2S时颜色由红色变为黄色；紫外灯下的颜色在接触H+时由无色变为黄色，检测ClO-和H2S时，颜色均变暗；光学机理指标：在酸性环境下，探针荧光被触发，此时遇待测物后，PET恢复至荧光淬灭，从而实施定量，同时伴随不同程度的吸收蓝移来鉴别两个待测物ClO-和H2S。4.权利要求1所述方法制备的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的应用，其特征在于：适用于生物样本中ClO-和H2S的定性、定量分析；其中生物样本包括胃液、胃粘膜、细胞。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：定量分析生物样本中ClO-和H2S时，适用于同时检测胃液或胃粘膜中的ClO-和H2S的含量；定性分析生物样本中ClO-和H2S时，适用于胃液样品中ClO-和H2S的肉眼监测、胃粘膜组织内ClO-和H2S的监测和活细胞内ClO-和H2S的监测。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针检测胃液或胃粘膜中内源性ClO-和H2S含量的方法，步骤包括：1）配制溶液配制探针BNBD储备液：准确称取基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2×10-4M的探针BNBD储备液；配制待测目标物ClO-储备液：准确称取待测目标物ClO-溶于水中，配制浓度为1×10-3M的ClO-储备液；配制待测目标物H2S储...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉霞，付强，姜翱，胡金莲，窦昆，陈光，尤进茂，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37