促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，包括：步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50‑400μmol/L；培养期间，每隔3天将罗汉果组培苗从固体培养基中取出，用清水将根部冲洗干净，静置10分钟，之后再将罗汉果组培苗重新接种回固体培养基中；步骤二、栽培罗汉果植株，将浓度为50‑400μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20‑30d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。本发明专利技术通过在罗汉果组培苗和栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯，诱导罗汉果甜苷V生物合成途径中关键酶基因UGT73AF1的高表达。

Method for promoting the expression of UGT73AF1 gene in grosvenor momordica fruit

The invention discloses a method for promoting the expression of UGT73AF1 gene of Momordica, including: 1, siraitiagrosvenorii seedling inoculation cultured in solid containing methyl jasmonate, jasmonic acid methyl ester concentration in solid medium was 50 400 mol/L; during the incubation period, every 3 days from siraitiagrosvenorii seedling the solid medium removed, rinse rinse root, and set aside for 10 minutes, then re inoculation of siraitiagrosvenorii seedling back to solid medium; step two, the concentration of cultivated Luohanguo plants, methyl jasmonate 50 400 mol/L after pollination 20 sprayed on the 30d surface to the surface of S.grosvenorii. Drop, early, middle and late spraying time, continuous spraying 5d. The present invention induces the high expression of key enzyme gene UGT73AF1 in the biosynthesis pathway of V by the application of methyl jasmonate in the tissue culture seedlings and the cultivation of Momordica fruit.

【技术实现步骤摘要】
促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法
本专利技术涉及基因技术，尤其涉及一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法。
技术介绍
罗汉果甜苷V属于葫芦烷型四环三萜类物质，罗汉果甜苷V生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(DMAPP)，二者是通过甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。来源于上述两途径的IPP或DMAPP经牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(FPP)，然后经角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧化酶(SE)的催化形成2,3-氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(CS)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在CYP450酶和葡萄糖基转移酶(UGT)的作用下，形成罗汉果甜苷V。异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，UGT基因的表达对罗汉果甜苷V的生物合成起着决定性作用。过表达UGT基因，可以促进罗汉果甜苷V的积累；相反，如果抑制UGT基因的表达，罗汉果甜苷V的产量将显著降低。现有技术中未见有促进罗汉果UGT73AF1基因表达的报道。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术设计开发了一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法。本专利技术提供的技术方案为：一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，包括：步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50-400μmol/L；培养期间，每隔3天将罗汉果组培苗从所述固体培养基中取出，用清水将根部冲洗干净，静置10分钟，之后再将罗汉果组培苗重新接种回所述固体培养基中；步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为50-400μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20-30d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法中，所述步骤一中，所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度21-25℃条件下培养30d。优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法中，所述的固体培养基配比为MS+6-BA1.5mg/L，IBA0.3mg/L，琼脂3.5g/L，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/L。优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法中，所述步骤一中，所述含有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到：用体积百分比浓度为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50-400μmol/L，将固体培养基灭菌并冷却至24-26℃。优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，还包括：步骤三、利用qRT-PCR检测所述步骤二栽培得到的罗汉果果实中的UGT73AF1基因表达。优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法中，所述步骤三中，采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA。本专利技术通过在罗汉果组培苗和栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯，短期内快速诱导罗汉果甜苷V生物合成途径中关键酶基因UGT73AF1的高表达，从而促进罗汉果甜苷V含量的显著提高。本专利技术操作简便，成本低，对环境友好，适于规模化生产，具有较强的实用性和推广价值。具体实施方式下面对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例一一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，包括：步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50μmol/L。所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度21℃条件下培养30d。所述的固体培养基配比为MS+6-BA1.5mg/L，IBA0.3mg/L，琼脂3.5g/L，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/L。培养期间，每隔3天将罗汉果组培苗从所述固体培养基中取出，用清水将根部冲洗干净，静置10分钟，之后再将罗汉果组培苗重新接种回所述固体培养基中。所述含有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到：用体积百分比浓度为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50μmol/L，将固体培养基灭菌并冷却至24-26℃。步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。步骤三、利用qRT-PCR检测所述步骤二栽培得到的罗汉果果实中的UGT73AF1基因表达。先将罗汉果果实进行处理，挑取果肉，切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。采用改良Trizol法提取罗汉果果实的总RNA。采用ABI7500实时荧光定量PCR仪。将RNA反转录为cDNA的反应体系为RNA10.0μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μL，RTPrimerMix1.0μL，5×PrimeScriptBuffer24.0μL，RNaseFreedH2O4.0μL；反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。采用PrimerPremier5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，UGT73AF1引物序列为(FP：CGCCATATGCACCACCACCACCACCACATGGTGGTTTCCACTTCCAGCG(SEQIDNO:1)，RP：CCCTCGAGTTATCTGATTAAATTAGTTGATT(SEQIDNO:2))，内参基因用UBQ5，序列为(FP：ATAAAAGACCCAGCACCACATTC(SEQIDNO:3)，RP：CCCTTGCCGACTACAACATCC(SEQIDNO:4))。qRT-PCR反应体系(20μL)为SYBRPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(2×)10.0μL，PCRForwardPrimer(10μM)0.8μL，PCRReversePrimer(10μM)0.8μL，ROXReferenceDyeofDyeII(50×)0.4μL，Template2.0μL，dH2O6.0μL。反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles，[95℃(5s)，95℃(34s)]。采用HPLC法测定罗汉果甜苷V的含量。色谱条件为：色谱柱：DIKMADiamomsil(TM)C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(梯度0-40min；10％线性升至40％；40.01-45mm；回至10％)；流速：1.0ml/min，检测波长：203nm。供试品样液的配制为：取罗汉果粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，其特征在于，包括：步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50‑400μmol/L；培养期间，每隔3天将罗汉果组培苗从所述固体培养基中取出，用清水将根部冲洗干净，静置10分钟，之后再将罗汉果组培苗重新接种回所述固体培养基中；步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为50‑400μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20‑30d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。

【技术特征摘要】
1.一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，其特征在于，包括：步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50-400μmol/L；培养期间，每隔3天将罗汉果组培苗从所述固体培养基中取出，用清水将根部冲洗干净，静置10分钟，之后再将罗汉果组培苗重新接种回所述固体培养基中；步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为50-400μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20-30d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。2.如权利要求1所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度21-25℃条件下培养30d。3.如权利要求2所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，其特征在于，所述的固体培养基配...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华政，韦荣昌，
申请(专利权)人：李华政，
类型：发明
国别省市：广西,45