改造的转铁蛋白DNA结合域、重组DNA聚合酶及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种改造的转铁蛋白DNA结合域，所述转铁蛋白为乳转铁蛋白LTF、血清铁传递蛋白TF、黑素转铁蛋白MTF或卵转铁蛋白OTF，所述各转铁蛋白的N端具有一段同源的DNA结合域，其中，DNA结合域的第10位、第20位分别为C；所述改造的转铁蛋白DNA结合域的氨基酸序列为：将第10位与第20位的C换为其他氨基酸，使其不能形成二硫键。本发明专利技术还公开了重组DNA聚合酶及其制备方法，采用上述改造的转铁蛋白DNA结合域与DNA聚合酶进行偶联，本发明专利技术还公开了一种含有上述重组DNA聚合酶的PCR检测试剂盒，本发明专利技术获得的重组DNA聚合酶不易受抑制剂抑制，可以实现直接PCR，同时可提高检测的灵敏度和稳定性。

Modified transferrin DNA binding domain, recombinant DNA polymerase and preparation method

The invention discloses a DNA transformation of the transferrin binding domain, the transferrin transferrin LTF, milk serotransferrin TF, melanotransferrin MTF or egg transferrin OTF, the transferrin N end has a homologous DNA binding domain, the DNA binding domain of tenth and twentieth respectively. C; the transformation of the combination of transferrin DNA amino acid sequence domain: tenth bit and twentieth bit C for other amino acids, which cannot form two disulfide bonds. The invention also discloses a recombinant DNA polymerase and its preparation method, using the DNA transformation of the transferrin binding domain with DNA polymerase coupling, the invention also discloses a PCR kit containing the recombinant DNA polymerase, the obtained recombinant DNA polymerase was not affected by inhibition of PCR, can be directly realized, at the same time can improve the detection sensitivity and stability.

【技术实现步骤摘要】
改造的转铁蛋白DNA结合域、重组DNA聚合酶及制备方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及改造的转铁蛋白DNA结合域、重组DNA聚合酶及制备方法。
技术介绍
脱氧核糖核酸(DNA)是生命遗传信息保存和传递的载体，细胞内参与脱氧核糖核酸合成的DNA聚合酶(DNApolymerase)是实现DNA分子自体复制和遗传信息传递功能的关键分子。生物技术的发展提供了DNA分子的体外复制方法，并由此发展起来的核酸分子检测技术已日益成为各种生物检测的关键技术，广泛应用于药物开发、食品安全性检测、病原微生物鉴定、疾病机理和药物靶向治疗等理论研究与检验之中。体外酶法合成DNA分子的关键是得到满足不同需要的耐热DNA聚合酶(thermostableDNApolymerase)。例如：进行PCR扩增的耐热DNA聚合酶、抗酶抑制剂(inhibitors)的耐热DNA聚合酶、能在超低模板浓度下扩增DNA的耐热DNA聚合酶等。临床体外诊断中经常需要对体液中的核酸进行扩增检测，而在体液中存在多种PCR反应抑制剂，如：氯化血红素、钙离子、血红蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白等。这些PCR抑制剂的存在限制了直接采用体液进行PCR扩增，通常需进行核酸纯化去除PCR反应抑制剂后，采用纯化后的核酸进行PCR扩增。国外的研究发现，利用古细菌(Archaebacteria)核酸结合蛋白的DNA结合结构域(DNAbindingmotif)与耐热DNA聚合酶(thermostableDNApolymerase)重组(chimericrecombination)，可构建出对模板DNA亲和力(infinitytoDNAtemplate)提高、且保留原DNA聚合酶各种功能的新型耐热DNA聚合酶。这种重组耐热DNA聚合酶具有以下特点：(1)与模板DNA分子的亲和力大大提高，能在模板DNA分子浓度很低的情况下与之结合，开启DNA合成；(2)与模板DNA分子亲和力提高的重组耐热DNA聚合酶，能在更加复杂的反应环境中，例如：含有污染物或干扰分子的DNA初级制品或原始材料溶液中，启动DNA合成；(3)与特异病原物基因组DNA的某些区段具有显著提高的亲和力，能在更低的模板DNA浓度或更加复杂的干扰分子存在时，开启DNA合成。这些特点，可改善核酸分子检测的过程(使之更简化和可规模化操作)和提高检测灵敏度及稳定性。而目前具有上述优点的重组DNA聚合酶数量较少，因此，急需加强这方面研发工作。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于获得不易受生物大分子(多糖、蛋白质)、有机和无机污染分子(为释放DNA和变性生物大分子加入化合物)等抑制的新型重组DNA聚合酶，实现直接PCR；获得与模板分子亲和力提高的新型重组DNA聚合酶，实现对更低浓度模板的扩增，提高检测的灵敏度和稳定性。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种改造的转铁蛋白DNA结合域，所述转铁蛋白为乳转铁蛋白LTF、血清铁传递蛋白TF、黑素转铁蛋白MTF或卵转铁蛋白OTF，所述各转铁蛋白的N端具有一段同源的DNA结合域，其中，DNA结合域的第10位、第20位分别为C；所述改造的转铁蛋白DNA结合域的氨基酸序列为：将所述DNA结合域中第10位与第20位的C换为其他氨基酸，使其不能形成二硫键。进一步地，所述第10位的C换为R，第20位的C换为A或者G。进一步地，将所述DNA结合域第1-5位的氨基酸换为KFKYK和/或第28-31位换为KKVK。进一步地，所述乳转铁蛋白LTF的DNA结合域采用人源，如SEQIDNo.1所示，或采用鼠源，如SEQIDNo.2所示；所述血清铁传递蛋白TF的DNA结合域采用人源，如SEQIDNo.3所示，或采用鼠源，如SEQIDNo.4所示；所述黑素转铁蛋白MTF的DNA结合域采用人源，如SEQIDNo.5所示，或采用鼠源，如SEQIDNo.6所示；所述卵转铁蛋白OTF的DNA结合域采用鸡源，如SEQIDNo.7所示。本专利技术还提供了一种重组DNA聚合酶的制备方法，采用上述改造的转铁蛋白DNA结合域与DNA聚合酶进行偶联，构建重组DNA聚合酶；或采用上述改造的转铁蛋白DNA结合域中相同的DNA结合域或不同的DNA结合域串联在一起后再与DNA聚合酶偶联，构建重组DNA聚合酶；或将上述构建的重组DNA酶与其他重组DNA聚合酶或未改造的DNA聚合酶混合后获得复合的重组DNA聚合酶。进一步地，所述DNA聚合酶为耐热DNA聚合酶或逆转录酶。进一步地，所述耐热DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。本专利技术还提供一种采用上述制备方法制备的新型的重组DNA聚合酶。本专利技术还提供了一种包含上述重组DNA聚合酶的PCR检测试剂盒。通过采用上述技术方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术获得了一种新型的DNA结合域—转铁蛋白DNA结合域，可用于与DNA聚合酶偶联构建重组DNA聚合酶，构建成的重组DNA聚合酶，不受生物大分子(多糖、蛋白质)、有机和无机污染分子(为释放DNA和变性生物大分子加入化合物)等抑制，可以实现直接PCR；进而可以简化检测程序，提高效率，便于操作；同时可以降低费用、减少成本、缩短检测时间，增加效益。另外，构建成的重组DNA聚合酶，与模板分子亲和力提高，可实现对更低浓度模板的扩增，提高检测的灵敏度和稳定性。附图说明上述仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。图1是实施例3中的重组耐热DNA聚合酶与TaqDNA聚合酶扩增效率比较结果图；图2是实施例3中的重组耐热DNA聚合酶与TaqDNA聚合酶扩增速度比较结果图；图3是实施例3中的重组耐热DNA聚合酶与TaqDNA聚合酶血清耐受性比较结果图。具体实施方式为了获得不易受抑制、对模板浓度要求低的新型的DNA聚合酶，本专利技术选择了通过重组的方式构建重组DNA聚合酶，通过大量研究发现，转铁蛋白的DNA结合域经过部分氨基酸替换改造后可用于构建具有上述效果的重组DNA聚合酶。转铁蛋白共有4种同源蛋白：乳转铁蛋白(Lactotransferrin，LTF)、血清铁传递蛋白(serotransferrin，TF)、黑素转铁蛋白(Melanotransferrin，MTF)、卵转铁蛋白(ovotransferrin，OTF)。这4种蛋白的N端具有一段同源的DNA结合域。其中，DNA结合域的第10位、第20位分别为C。实施例1本实施例检测了3种人源、3种鼠源、1种鸡源的转铁蛋白的DNA结合域，氨基酸序列分别如下：人LTF(HLTF)：GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVR(SEQIDNo.1)人TF(HTF)：AVPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVI(SEQIDNo.3)人MTF(HMTF)：VLGGMEVRWCATSDPEQHKCGNMSEAFREAG(SEQIDNo.5)鼠LTF(MLTF):LAKATTVQWCAVSNSEEEKCLRWQNEMRKVG(SEQIDNo.2)鼠TF(MTF)：AVPDKTVKWCAVSEHENTKCISFRDHMKTVL(SEQIDNo.4)鼠MTF(MMTF)：VVCVMEVQWCTISDAEQQKCKDMSEAFQGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造的转铁蛋白DNA结合域，其特征在于，所述转铁蛋白为乳转铁蛋白LTF、血清铁传递蛋白TF、黑素转铁蛋白MTF或卵转铁蛋白OTF，所述各转铁蛋白的N端具有一段同源的DNA结合域，其中，DNA结合域的第10位、第20位分别为C；所述改造的转铁蛋白DNA结合域的氨基酸序列为：将所述DNA结合域中第10位与第20位的C换为其他氨基酸，使其不能形成二硫键。

【技术特征摘要】
1.一种改造的转铁蛋白DNA结合域，其特征在于，所述转铁蛋白为乳转铁蛋白LTF、血清铁传递蛋白TF、黑素转铁蛋白MTF或卵转铁蛋白OTF，所述各转铁蛋白的N端具有一段同源的DNA结合域，其中，DNA结合域的第10位、第20位分别为C；所述改造的转铁蛋白DNA结合域的氨基酸序列为：将所述DNA结合域中第10位与第20位的C换为其他氨基酸，使其不能形成二硫键。2.根据权利要求1所述的改造的转铁蛋白DNA结合域，其特征在于，所述第10位的C换为R，第20位的C换为A或者G。3.根据权利要求1或2所述的改造的转铁蛋白DNA结合域，其特征在于，将所述DNA结合域第1-5位的氨基酸换为KFKYK和/或第28-31位换为KKVK。4.根据权利要求1或2所述的改造的转铁蛋白DNA结合域，其特征在于，所述乳转铁蛋白LTF的DNA结合域采用人源，如SEQIDNo.1所示，或采用鼠源，如SEQIDNo.2所示；所述血清铁传递蛋白TF的DNA结合域采用人源，如SEQIDNo.3所示，或采用鼠源，如SEQIDNo.4所示；所述黑素转铁蛋白MTF的DNA结合域采用人源，如SEQIDNo.5所示，或采用鼠源，如SEQIDNo.6所示；所述卵转铁蛋白OTF的DNA结合域采用鸡源，如SEQIDNo.7所示。5.根据权利要求3所述的改造的转铁蛋白DNA结合域，其特征在于，所述乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华华，
申请(专利权)人：成都福际生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51