一种PD‑1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种PD‑1基因修饰人源化动物模型的制备方法，该方法利用CRIPSR/Cas9技术，通过构建打靶载体，利用同源重组的方式将小鼠PD‑1基因的部分片段替换为人PD‑1基因片段，从而制备出基因修饰人源化小鼠，该小鼠能正常表达含有人PD‑1蛋白功能域的PD‑1蛋白，可以作为PD‑1、PD‑L1等信号机理研究，调节剂筛选，毒理研究的动物模型，这对于研究PD‑1基因的功能，以及新药研发具有重要的应用高价值。

The construction method and application of PD 1 gene modified humanized animal model

The present invention provides a method for preparing PD 1 gene modified humanized animal model, the method of using CRIPSR/Cas9 technology, through the construction of the targeting vector by homologous recombination method will replace the partial fragment of mouse PD gene 1 to PD 1 gene fragments, thus preparing gene modified humanized the expression of normal mice, mice containing human PD 1 protein functional domains of PD protein can be used as 1, PD 1, PD L1 signal regulator screening, mechanism research, animal models of toxicological studies, this study for the PD 1 gene function, as well as the development of new drugs has important application of high value.

【技术实现步骤摘要】
一种PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用
本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于CRISPR/Cas9技术的PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
人源化动物模型是指带有人类功能性基因、细胞或组织的动物模型。这种模型通常作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。研究人类复杂疾病的发病机制,筛选有效药物,需要理想的动物模型来进行大量的体内试验.小鼠是应用最为广泛的生物模型之一，但考虑到小鼠与人类在生理、病理等诸多方面存在差异,构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型尤为重要。利用基因修饰的方法，将人类基因“放置”在大、小鼠染色体上所制备的人源化基因动物模型，是进行一些人类疾病研究的方法。肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，《Science》杂志将肿瘤免疫疗法评为2013年十大科学突破第一位。目前，针对PD-1/PD-L1通路抑制剂的研究受到了特别的关注。PD-1(programmeddeath-1)主要表达于T细胞及初级B细胞表面，PD-1的两个配体(PD-L1和PD-L2)，广泛表达于抗原提呈细胞(APCs)等。PD-1与其受体的相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡，进而逃避免疫系统的攻击。抑制PD-1与其配体的结合，可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤视野，进而达到杀伤肿瘤组织及治疗癌症的作用。目前有国内外很多大公司开始正在加紧开发抗PD-1药物。最熟悉的全球制药巨头当属BMS和默沙东，两家公司的Opdivo和Keytruda均已拿下黑色素瘤和肺癌适应症。2015年11月，FDA批准Opdivo用于晚期肾细胞癌，Opdivo头颈癌关键III期临床已成功完成。在2016年1月举办ASCOGI2016上公布的结果显示，这两款药在管癌、胃癌显示积极疗效。在我国，2015年底，君实生物成为首家PD-1单抗获批临床的企业；2016年1月，百济神州的PD-1单抗BGB-A317通过FDA的新药研究申请审评，获准在美国开展临床试验；2月19日，恒瑞医药开发的注射用SHR-1210(PD-1单克隆抗体)获得药物临床试验批件，主要适应症为实体瘤；2月22日，沃森生物发布公告称，其子公司嘉和生物研发的抗PD-1单抗(杰诺单抗注射液)产品临床研究申请获得受理，主要的潜在适应症包括各种血癌及黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等多种实体瘤。截止2016年3月，国内已有两家PD-1单抗药物获得了临床试验批件，另有两家正在受理中。药厂之间激烈的竞争表明了对该类药物高度认同，PD-1抑制剂可能成为医药史上一个重要的里程碑。美国国家癌症研究所(NCI)将PD-1列为140种癌症免疫治疗途径和分子中的第二最有前景的潜在靶点。由于免疫疗法有较明显的免疫毒性，如皮炎、大肠炎、垂体炎等，这种副作用与免疫应答程度直接相关，很难通过剂量调整避免。PD-1单抗nivolumab、MK-3475都报道了肺炎这一严重不良反应，因此严格的药物筛选程序非常重要。但由于人类生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上，而人源化动物模型则能很好地“复制”人类某些功能，这种模型通常被用做人类疾病体内研究的活体替代模型。人源化动物模型的应用很广泛，比如在肿瘤、艾滋病、传染病、人类退化性疾病、血液病研究领域等都有很强的适用性。目前已有一些PD-1基因相关的动物模型，如Nihimura等人早在2001年已经制备了PD-1敲除的BALB/c小鼠，这些模型主要用于研究PD-1基因的功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究。鉴于PD-1基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的药效试验更有效并提高研发成功率，针对现有技术的不足和缺陷，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种PD-1基因修饰人源化非人哺乳动物模型。本专利技术的第二专利技术目的在于提出该PD-1基因修饰人源化非人哺乳动物的制备方法。本专利技术的第三专利技术目的在于提出该模型的应用。为了实现本专利技术的目的，采用的技术方案为：本专利技术提供一种制备PD-1基因修饰人源化动物模型的方法，所述方法包括：1)构建打靶载体：从基因组DNA经PCR方法扩增获得同源臂，与待引入的hPD-1片段连接至打靶载体；2)构建sgRNA：根据靶位点设计并选择sgRNA，将sgRNA连接至载体质粒并进行体外转录；3)将打靶载体，转录的sgRNA转入到胚胎细胞，移植至假孕动物体内；4)对得到的嵌合体动物进行基因型鉴定，筛选基因成功敲进的阳性动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得纯合子。基于上述技术方案，本专利技术提供一种PD-1基因修饰人源化的动物模型，所述动物为非灵长类哺乳动物，其基因组中含有人PD-1基因片段，能正常表达PD-1功能蛋白，且表达的蛋白含有人PD-1蛋白的功能域。所述的PD-1基因修饰是针对PD-1基因第二外显子进行的基因修饰。进一步地，所述非灵长类哺乳动物为啮齿类动物。更进一步，所述啮齿类动物为小鼠。优选地，所述小鼠的品系为C57BL/6。本专利技术提供的PD-1基因修饰人源化的动物模型，其PD-1基因的第11053-11385位核苷酸用人DNA片段进行替代，保留包括跨膜区在内的其他小鼠PD-1区域；所述人DNA片段如SEQIDNO：21所示。在本专利技术的一个实施例中，提供的PD-1基因修饰人源化的动物模型，其PD-1基因的第11053-11385位核苷酸用人DNA片段进行替代，保留第二外显子左右边缘14/13bp和包括跨膜区在内的其他小鼠PD-1区域；所述人DNA片段如SEQIDNO：21所示。优选的，所述动物模型由上述方法制备而成。本专利技术提供一种人源化小鼠PD-1基因的DNA序列，DNA序列编码的蛋白含有人PD-1蛋白的功能域。本专利技术提供一种人源化小鼠PD-1基因的DNA序列，是小鼠PD-1基因的第11053-11385位核苷酸用人DNA片段进行替代，保留包括第二外显子左右边缘各14/13bp和跨膜区在内的其他小鼠PD-1区域，所述人DNA片段如SEQIDNO：21所示或与该片段具有80％及以上同源性的DNA片段，该人源化小鼠PD-1基因的DNA序列含有SEQIDNO：14所示的核苷酸序列或与该人源化小鼠PD-1基因的DNA序列具有80％及以上同源性的DNA片段。优选的，用于扩增该人源化小鼠PD-1基因的DNA序列的上下游引物序列如SEQIDNO:22-23所示。进一步，所述的人源化小鼠PD-1基因的DNA序列，其CDS序列如SEQIDNO:15所示或与SEQIDNO:15具有80％及以上同源性的片段，其mRNA序列如SEQIDNO:16所示或与SEQIDNO:16具有80％及以上同源性的片段，其编码的蛋白序列如SEQIDNO：17所示或其特异性氨基酸片段，且功能不变。本专利技术提供了一种上述人源化小鼠PD-1基因的DNA序列在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源化小鼠PD‑1基因的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人PD‑1蛋白的功能域。

【技术特征摘要】
2016.06.28 CN 20161048776471.一种人源化小鼠PD-1基因的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人PD-1蛋白的功能域。2.根据权利要求1所述的人源化小鼠PD-1基因的DNA序列，是小鼠PD-1基因的第11053-11385位核苷酸用人PD-1基因的DNA片段进行替代，且保留包括跨膜区在内的其它小鼠PD-1区域，所述人PD-1基因的DNA片段如SEQIDNO：21所示或与该片段具有80％同源性的DNA片段，该人源化小鼠PD-1基因的DNA序列含有SEQIDNO：14所示的核苷酸序列或与该人源化小鼠PD-1基因的DNA序列具有80％同源性的DNA片段。3.根据权利要求1所述的人源化小鼠PD-1基因的DNA序列，其特征在于，其CDS序列如SEQIDNO:15所示或与SEQIDNO:15具有80％及以上同源性的片段，其编码mRNA的序列如SEQIDNO:16所示或与SEQIDNO:16具有80％及以上同源性的片段，其编码的蛋白序列如SEQIDNO：17所示或其特异性氨基酸片段，且功能不变。4.权利要求1-3任一所述的DNA序列在构建PD-1基因修饰人源化的动物模型中的用途。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，将含有人源化小鼠PD-1基因的DNA序列的表达载体与Cas9mRNA，小鼠PD-1基因第二外显子的sgRNA质粒的体外转录产物注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD-1基因修饰人源化小鼠模型。6.特异性靶向小鼠PD-1基因第二外显子的sgRNA，其靶位点序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:8所示。7.根据权利要求6所示的sgRNA，其特征在于，合成序列如SEQIDNO:3所示靶位点的上下游单链序列分别如SEQIDNO:9-10所示；合成序列如SEQIDNO:8所示靶位点的上下游单链序列分别如SEQIDNO:11-12所示。8.含有权利要求6或7所述sgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。9.权利要求6或7所述sgRNA或权利要求8所述的CRISPR/Cas9打靶载体在制备PD-1基因修饰动物模型中的应用。10.一种制备PD-1基因修饰人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求1-3任一所述的人源化小鼠PD-1基因的DNA序列、3’同源臂和5’同源臂连接至质粒上，构建人源化小鼠PD-1基因第二外显子的同源重组表达载体；所述5’同源臂如SEQIDNO:18所示，所述3’同源臂如SEQIDNO:24所示；(2)构建小鼠PD-1基因第二外显子的sgRNA的质粒；(3)将步骤(2)的体外转录产物与步骤(1)的表达载体以及和Cas9mRNA注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD-1基因修饰人源化小鼠模型。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，是以野生型C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增5’同源臂片段和3’同源臂片段，扩增的引物对序列分别如SEQIDNO:19-20和SEQIDNO:25-26所示；所述质粒为PV-4G。12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，步骤(2)小鼠PD-1基因第二外显子的sgRNA的质粒是将权利要求6或7所述sgRNA连接至pT7-sgRNA质粒获得。13.一种PD-1基因修饰人源化的动物模型，其特征在于：所述动物为非灵长类哺乳动物，其基因组中含有人PD-1基因片段，能正常表达PD-1功能蛋白，且表达的蛋白含有人PD-1蛋白的功能域；优选的，所述非灵长类哺乳动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。14.根据权利要求13所述的动物模型，其特征在于，其PD-1基因的第11053-11385位核苷酸用人PD-1基因的DNA片段进行替代，且保留包括跨膜区在内的其它小鼠PD-1区域；所述人PD-1基因的DNA片段如SEQIDNO：21所示。15.根据权利要求13或14所述的动物模型，其特征在于，所述动物模型由权利要求10-12任一所述的方法制备而...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，白阳，黄蕤，周小飞，胡玉婷，郭雅南，杜吉超，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11