优化的动物蛋白基因OCX-36及其原核表达载体的构建制造技术

本发明专利技术公开了一种优化的动物蛋白基因OCX‑36及其原核表达载体的构建方法和应用，采取的技术方案是对OCX‑36基因稀有密码子进行改造优化，并切除了信号肽，将优化的OCX‑36基因与载体连接，构建重组质粒pMD‑19T‑OCX‑36，转入到大肠杆菌C41(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆进行培养、蛋白表达，菌体细胞超声破碎、离心、收集上清液经一次镍柱亲和层析即可获得蛋白rOCX‑36。本发明专利技术通过对OCX‑36基因序列的优化，实现了蛋白rOCX‑36的可溶性表达，解决了其难于原核表达的技术问题，表达蛋白对患有结肠炎的小鼠具有明显改善病情的效果，显示rOCX‑36可用于制备治疗结肠炎的药物。

Optimization of animal protein gene OCX 36 and construction of prokaryotic expression vector

The invention discloses a method for optimizing the animal protein gene OCX 36 and prokaryotic expression vector construction method and application, the adopted technical scheme is to transform the optimization of OCX gene 36 rare codons, and removal of the signal peptide, connect the optimized OCX gene and 36 vector, the recombinant plasmid pMD 19T OCX 36, transferred to Escherichia coli C41 (DE3) competentcells, expression of the positive clones were cultured, protein, cell sonication, centrifugation, supernatant was collected by a nickel affinity chromatography to obtain protein rOCX 36. The present invention by optimizing the sequence of OCX 36 gene, the expression of soluble protein rOCX 36, to solve the technical problems difficult to prokaryotic expression, protein expression has obvious effect on improving the disease suffering from colitis mice showed that rOCX 36 can be used for preparing medicine for treating colitis.

【技术实现步骤摘要】
优化的动物蛋白基因OCX-36及其原核表达载体的构建
本专利技术涉及分子生物学和生物
，具体地指一种优化的动物蛋白基因OCX-36及其原核表达载体的构建。
技术介绍
由于大肠杆菌表达系统具有培养周期短、表达水平高、生产成本低等优点，是基因工程中应用最为广泛的表达系统，成为基因表达的重要工具，尤其是进入后基因组时代以来，有关蛋白结构以及功能研究的开展，对基因表达的要求更高，大肠杆菌往往是表达的第一选择。然而，动物基因在大肠杆菌系统中表达具有很大的难度和不确定性，虽然已有某些动物基因在大肠杆菌系统中实现成功表达，但效果差别很大，方法各不相同，由于是异源表达，外源的基因会被大肠杆菌防御系统识别并降解造成无法表达，诱导条件、外源基因的性质、菌株种类等等诸多因素都会造成目标基因不表达。另外，大肠杆菌系统通常采用的强启动子容易造成蛋白质折叠不正确，形成包涵体，大肠杆菌没有内质网和高尔基体，合成的肽链无法加工成为有活性的蛋白质。Ovocalyxin-36(OCX-36)是原鸡属(Gallusgallus)特有的基因，出现在鸟类和哺乳动物分化之后，源于人脂多糖结合蛋白/人杀菌通透性增加蛋白/腭肺鼻上皮癌关联蛋白(BPI/LBP/PLUNC)基因簇的顺接重复，氨基酸序列比对搜索结果显示与BPI/LBP/PLUNC家族蛋白有20-25％同源，实验也证明该蛋白具有显著的抗菌活性。同时研究表明OCX-36mRNA的表达发生在蛋壳形成组织，并且在蛋壳形成钙化阶段表达上调，因此OCX-36与生物矿化(如蛋壳形成)息息相关[Ovocalyxin-36andotherLBP/BPI/PLUNC-likeproteinsasmolecularactorsofthemechanismsoftheavianeggnaturaldefences.BiochemSocTrans,2011,39:971-976]。OCX-36是一种前体蛋白，其溶解性较差，并且基因序列中含有串联的稀有密码子，因此作为动物基因的OCX-36在大肠杆菌系统异源表达更加困难，目前国内外还没有关于OCX-36基因体外表达的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供了一种优化的动物蛋白基因OCX-36，该优化基因解决了目前动物蛋白基因OCX-36无法在大肠杆菌系统中表达或者在大肠杆菌系统中不能稳定表达的缺点。本专利技术的目的之二是提供了一种优化的动物蛋白基因OCX-36表达载体的构建方法，该方法通过优化的基因序列成功构建了重组的表达载体。本专利技术的目的之三是提供了一种应用，该应用是利用构建的重组的表达载体制备大量、高纯度的可溶性蛋白rOCX-36。为实现上述目的，本专利技术提供的一种优化的动物蛋白基因OCX-36，它的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术通过对OCX-36基因进行分析，基于大肠杆菌的密码子适应指数(CAI)0.66(一般认为CAI值大于0.8易于表达)，其序列中出现连续的稀有密码子，需要对OCX-36基因序列进行优化，提高表达成功率。本专利技术还提供了上述基因OCX-36编码的蛋白Ovocalyxin-36(简写：rOCX-36)，它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种重组表达载体pET28b-OCX-36，它含有上述优化的动物蛋白基因OCX-36。作为优选方案，所述优化的动物蛋白基因OCX-36插入表达载体pET28b(+)的酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间。本专利技术还提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌C41(DE3)感受态细胞。本专利技术还提供了一种上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)对OCX-36编码基因进行分析，根据大肠杆菌的密码子偏好性，对OCX-36基因进行稀有密码子替换，并调整密码子适应指数，同时切除了21个氨基酸长度的信号肽；得到优化的动物蛋白基因OCX-36，其核苷酸序列如核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；2)根据优化的动物蛋白基因OCX-36序列设计特异性引物对，该引物对分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点，引物序列分别为：F-BamHⅠ:CGGGATCCATGAAGCCGCTGAAGCTTTT，如SEQIDNO.3所示；R-EcoRⅠ:CGGAATTCTCACACGGAGATCGCCAACA，如SEQIDNO.4所示；3)以优化的动物蛋白基因OCX-36的序列为模板，进行PCR，得到PCR产物；4)将PCR产物连接到质粒pMD-19T上，得到质粒pMD-19T-OCX-36，5)BamHⅠ和EcoRⅠ分别对pMD-19T-OCX-36和pET28b(+)进行双酶切，回收得到酶切化的OCX-36和线性化的pET28b(+)；6)将酶切化的OCX-36和线性化的pET28b(+)用T4连接酶4℃连接过夜，得到连接产物pET28b-OCX-36。本专利技术还提供了一种上述重组表达载体的宿主细胞制备Ovocalyxin-36蛋白的方法，包括以下步骤：1)将连接产物转化大肠杆菌C41(DE3)或者BL21(DE3)，T7E(DE3)感受态细胞；2)冰浴30min后，42℃热激90s，600μL无抗性LB复苏45min，取适量复苏后的菌液于37℃培养箱中过夜；3)异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，浓度为1mM，诱导温度20～37℃，诱导4h；4)取诱导表达的菌液，加入pH7.5的PBS缓冲液，12000×g离心10min，超声破碎后离心，保留上清液；5)上清液上样至Ni-NTAHisbind树脂，结合液为20mM咪唑、10mMTris-HCl、500mMNaCl，pH8.0；洗脱液为200mM咪唑、10mMTris-HCl、500mMNaCl，pH8.0，洗脱得到蛋白rOCX-36。本专利技术还提供了一种利用上述制备的蛋白Ovocalyxin-36在制备抗炎的药品中的应用。作为优选方案，蛋白Ovocalyxin-36在制备结肠炎的药品中的应用。本专利技术还提供了一种利用上述制备得到蛋白Ovocalyxin-36在制备结肠炎的药品中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种采用大肠杆菌表达体系获取原鸡属特有的OCX-36蛋白的方法，优化其基因结构，成功建立了蛋白rOCX-36的可溶性表达技术。利用该技术可以获得占总表达蛋白40％-50％的蛋白rOCX-36，且分离纯化只需要一次亲和层析，生产成本低，易于大量表达，适于工业化生产。OCX-36在大肠杆菌中的成功克隆表达，将有利于工业化生产应用，在生物、医药、食品、材料等领域具有十分广阔的应用前景。附图说明图1为实验技术流程图；图2为重组质粒pET28b-OCX-36的质粒图谱，图中，Kan表示卡那抗性，BamHⅠ和EcoRⅠ为双酶切位点，优化的动物蛋白基因OCX-36为目的基因；图3为优化的动物蛋白基因OCX-36的PCR扩增结果图，图中，M表示核酸Marker，1表示扩增获得的优化的动物蛋白基因OCX-36；图4为质粒双酶切检测结果图，图中，M表示核酸Marker，1、2表示酶切之后的载体和优化的动物蛋白基因OCX-36；图5为测序结果分析比对；图6为表达产物的Westblot结果图；图中，－：阴性对照；+：阳性对照；1.E.C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种优化的动物蛋白基因OCX‑36，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种优化的动物蛋白基因OCX-36，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种权利要求1所述基因OCX-36编码的蛋白Ovocalyxin-36，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于：它含有权利要求1所述优化的动物蛋白基因OCX-36的表达载体。4.根据权利要求3所述重组表达载体，其特征在于：所述表达载体为pET28b(+)。5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于：所述优化的动物蛋白基因OCX-36插入表达载体pET28b(+)的酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间。6.含有权利要求3～5中任意一项所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。7.一种权利要求3～5中所述重组表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)对OCX-36编码基因进行分析，根据大肠杆菌的密码子偏好性，对OCX-36基因进行稀有密码子替换，并调整密码子适应指数，同时切除了21个氨基酸长度的信号肽；得到优化的动物蛋白基因OCX-36，其核苷酸序列如核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；2)根据优化的动物蛋白基因OCX-36序列设计特异性引物对，该引物对分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点，引物序列分别为：F-BamHⅠ:CGGGATCCATGAAGCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：马美湖，张茂杰，李述刚，黄群，金永国，付星，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42