一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因，所述内参基因为RPL13基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术选取的RPL13内参基因在温度为0℃、10℃、20℃、30℃和40℃的胁迫条件下均能稳定表达，因此，RPL13基因可作为内参基因用于研究分析麦红吸浆虫不同温度胁迫下功能基因的表达，提高了荧光定量PCR方法检麦红吸浆虫基因转录表达水平的准确性；避免了由内参基因mRNA表达稳定性差造成的麦红吸浆虫基因mRNA表达定量检测精确度低的问题，同时也为后续不同温度条件下麦红吸浆虫基因的定量提供了参考。

A reference gene detection of Wheat Midge in different temperature stress gene expression and its application

The invention discloses a reference gene for detecting the wheat midge in different temperature stress gene expression, the reference genes for RPL13 gene, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1. RPL13 reference genes selected by the invention in the temperature stress condition of 0 C and 10 C, 20 C, 30 C and 40 C can stable expression. Therefore, RPL13 gene can be used as a reference gene for gene expression analysis under different temperature sitodiplosismosellanagehin stress, improve the fluorescent quantitative PCR method. Wheat midge gene transcription and expression level of accuracy; to avoid the poor stability of the wheat midge caused by mRNA gene expression quantitative detection of low accuracy by mRNA gene expression, but also provides a reference for the quantitative sitodiplosismosellanagehin base under different temperature conditions for the follow-up.

【技术实现步骤摘要】
一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因及其应用。
技术介绍
随着现代人类工业的发展的影响，全球气候正在逐渐变暖。昆虫是变温动物，温度对昆虫的影响至关重要。过高的环境温度将直接使昆虫的生长发育、繁殖、种群发展及生存等受到严重的改变。以往，人们根据环境气候条件、虫群基数及食物等来预测预报害虫的发生，但是高温条件改变了昆虫的生存状况，导致在昆虫预测报中信息偏差而不准确。不同种类的昆虫对高温胁迫的耐受性表现出高低不同，有些昆虫在高于正常生长温度较多的条件下仍能正常生存，而有些昆虫则对温度的变化极其敏感，较小范围的温度波动就可能对其产生较大的影响甚至死亡。麦红吸浆虫((Sitodiplosismosellana，Diptera:Cecidomyiidae)属于双翅目瘿蚊科，是广泛分布在北半球小麦产区的一种主要害虫，以幼虫潜伏在颖壳内吸食正在灌浆的汁液，造成麦粒瘪疮、空壳或霉烂而减产，全球每年因小麦吸浆虫的为害而造成的经济损失高达数亿美元。在中国，主要为害冬小麦，也为害一些其他禾本科植物如纤毛鹅观草、节节麦、大麦和雀麦。麦红吸浆虫通常一年或多年发生一代，春季成虫羽化后产卵在新抽出的穗上，幼虫孵化后进入颖壳吸食麦粒。两周后遇到降雨或重露水落入土壤中越夏和越冬。若春季干旱年份越冬幼虫会继续滞育直至下年春天。随着气候变暖，春季温度的增加，小麦吸浆虫发生区不断向北移动，新发生区发生程度呈现加重的趋势。在整个长江中下游—华北平原冬麦区，小麦吸浆虫发生面积、防治成本和防治后的小麦产量损失的增加，主要来自华北的新发生区。从1985年到2014年期间，新发生区累计发生面积16.66百万公顷，防治成本累计达到390.26百万美元，防治后小麦产量损失累计897.16千吨。气候变暖导致吸浆虫在华北地区发生，已经给小麦生产造成了严重后果。冬季低温及夏季的高温对吸浆虫的扩散、爆发有重要推动作用，因此，研究麦红吸浆虫在不同温度条件下的耐受性及其作用机理对于吸浆虫在农业生产上发生的预测预报、综合防控及吸浆虫发生北界的研究具有重要的意义。研究麦红吸浆虫不同温度影响下基因的表达情况并进一步对功能有一个初步了解，实时PCR(real-timequantitativePCR)作为一种在转录水平上对mRNA表达量进行定量的方法，具有快速、可重复性好和高灵敏度等优点，是监测不同温度影响条件下基因表达情况的有力的工具。实时荧光定量PCR是一种强有力的检测基因表达谱的方法,可以分析基因在不同时期的表达差异以及经过不同处理的样本间基因的表达差异等等。在分析中选用一种合适的内参基因对目的基因的表达量进行校正可以提高该方法的灵敏度和重复性。由于目前许多目的基因的实时荧光定量研究是在多个不同的组织中进行比较的，因此需要尽量一致的实验条件，但由于样品在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别，因此实验中的表达差异比较大。为了降低实验中的差异，通常在研究中会选择看家基因作为内参基因对目的基因进行校正和标准化，以校正转录效率和cDNA用量，弥补制备过程中样本纯度和浓度的差别，从而避免mRNA转录的高动态性、样品操作及下游处理步骤的多变性造成的误差，因此选择合适的内参基因成为实验结果准确的关键。但是没有一种内参基因mRNA表达水平在所有的条件下是一成不变的。在各种因素影响下，如在实验条件下，细胞发育的不同阶段，内参基因的表达水平是不同的。因此，研究不同的环境条件下，某一有机体内基因的表达情况，内参基因的选择至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因及其应用。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因，所述内参基因为RPL13(RibosomalproteinL13)基因，其核苷酸序列为：AACTTAGCCTTACGTTTACGTTCCAAATTTTTGACAACGTCTTGGTATTGCCATCCGACTTCATGTGACAAACGGCCAATTTTGCAGTATTTGCGATCTGATCGCAAGCACAACACTCTAAGGGCAGTTGGGACGCAGACACGACGTTTCTTTTCGTATGCTGGTGGGATACCGTCAAACACACGCAAACGTTTCAATGCGGCTTGACCACGGAGAGTCTTGTGTGGGATCATTCCTCGGACAGCCTTGTAGAAAATACGGCATGGAGCTCTAAAGTGGAATGGTCCGCGAGCTGGGTTGACATTACAGCGCTTGCGCAAGTAATTCAAGTACTTGACTTTGTTTCTATAGAAATGACCTGAAAGGGTCAATTCTTCGCATCGTACAACGACGACTTTGCCACCTTGCAAAAGGTTTTTGGCTACAACTGAAGCAAGTCGACCGACCAAGTGGCCACGGCCGTCGATGATTACTGCCTTATTGTTTAAACCTGGCATGTTTACGCAGCAAATACAAAAAGAATGGCCGAAAGG(SEQIDNO.1)。根据上述的内参基因，优选地，所述不同温度胁迫为：将麦红吸浆虫幼虫分别在0℃、10℃、20℃、30℃和40℃下各处理0.5h。本专利技术的RPL13基因能够作为检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因应用。根据上述的应用，所述不同温度胁迫为：将麦红吸浆虫幼虫分别在0℃、10℃、20℃、30℃和40℃下各处理0.5h。本专利技术用于检测RPL13基因表达所用的引物为：上游引物F1：CTTGGTATTGCCATCCGACT(SEQIDNO.7)；下游引物R1：TTGCGTGTGTTTGACGGTAT(SEQIDNO.8)。本专利技术的积极有益效果：本专利技术首次从6种候选内参基因中筛选出麦红吸浆虫不同温度胁迫下能最稳定表达的内参基因RPL13基因，所述RPL13基因可作为内参基因用于研究分析麦红吸浆虫不同温度胁迫下功能基因的表达，提高了荧光定量PCR方法检麦红吸浆虫基因转录表达水平的准确性；避免了由内参基因mRNA表达稳定性差造成的麦红吸浆虫基因mRNA表达定量检测精确度低的问题；同时，本专利技术为后续不同温度条件下麦红吸浆虫基因的定量提供了参考，对定量实验的结果准确性提供了保证。此外，本专利技术设计的检测RPL13基因的PCR引物具有特异性，而且其扩增效率达到了96％以上，标准曲线回归系数均大于0.92，因此该引物能够为准确定量检测RPL13基因提供坚实基础。附图说明图1为本专利技术6个候选内参基因的实时荧光定量PCR溶解曲线图。图2为本专利技术6个候选内参基因的标准曲线图。图3为geNorm分析6个候选内参基因的表达稳定度。图4为麦红吸浆虫PDS基因在0℃、10℃、20℃、30℃和40℃的相对表达量。具体实施方式以下通过具体的实施例对本专利技术作进一步说明，但并不限制本专利技术的范围。在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本专利技术的保护范围。若未特别指本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因，其特征在于，所述内参基因为RPL13基因，其中，所述RPL13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因，其特征在于，所述内参基因为RPL13基因，其中，所述RPL13基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1。2.根据权利要求1所述的内参基因，其特征在于，所述不同温度胁迫为：将麦红吸浆虫幼虫分别在0℃、10℃、20℃、30℃和40℃下各处理0.5h。3.根据权利要求1所述的内参基因，其特征在于，检测RPL13基因表达所用的引物为：上游引物F1：CTTGGTATTGCCATCCGACT；下游引物R1：TTGCGTGTGTTTGAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩中军，段云，李彤，蒋月丽，苗进，王强，武予清，
申请(专利权)人：河南省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41