一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于：所述目的蛋白在胞内大量积累，其就被大量分泌到发酵液中。其不依赖于信号肽或者特征结构，与现有的Sec途径、Tat途径、Com系统和ABC转运途径有本质上差异。当任一目的蛋白在细胞内大量表达，就可以通过这一途径大量分泌到细胞外，最大分泌量可以达到g/L级别。不仅克服了现有分泌途径分泌量低，通用性差的特点，还可以无选择性地将目的蛋白分泌到发酵液中，降低后期分离纯化的难度。

A method for efficient secretion of heterologous proteins by Bacillus sp.

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular relates to a method for using bacillus efficient secretion of heterologous proteins, characterized in that: the accumulation of the protein in the cell. It is abundantly secreted into the broth. It does not depend on the signal peptide or characteristic structure, and is essentially different from the existing Sec pathway, Tat pathway, Com system and ABC transport pathway. When any target protein is expressed abundantly in the cell, it can be secreted into the cell largely through this pathway, and the maximum amount of secretion can reach the g/L level. It can not only overcome the low secretion and poor universality of the secretory pathway, but also selectively target the protein to the fermentation broth, and reduce the difficulty of separation and purification in the late stage.

【技术实现步骤摘要】
一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法。
技术介绍
蛋白表达技术是现代生物学的核心技术之一，表达蛋白不仅可用于生物学研究，也可以提供商业化的蛋白制品，如重组疫苗、重组胰岛素、细胞因子等产品。目前常用的表达系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，但是它们都各有明显的优缺点。大肠杆菌表达系统研究最充分，有多种选择，最常用的是Novagen的pET表达系统，其利用噬菌体的T7RNA聚合酶可专一性地转录T7启动子后的目的基因，在最佳条件下，目的蛋白可以达到大肠杆菌总蛋白的50％以上。尽管具有表达效率高，培养成本低等优点，但是缺点也非常明显：蛋白容易形成包涵体，复性难度和成本较高；大肠杆菌不能对蛋白进行糖基化修饰；细胞壁含有脂多糖(内毒素)，不易完全去除；胞内蛋白种类多，目的蛋白纯化过程中不易去除各种杂质蛋白。另外一个常用的表达系统是酵母表达系统，其具有表达量高，可诱导，蛋白分泌到胞外易于纯化，并且具有一定的翻译后修饰能力等优点，但是缺点是部分表达产物易降解，表达量不可控，大于30KDa的蛋白几乎不能分泌。动物细胞和昆虫细胞表达系统的特点是具有完整的修饰系统，表达产物具有或者类似的天然活性，没有内毒素污染，但是表达量低，周期长，技术要求高，生产成本高。枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于水体、空气、土壤中的革兰氏阳性菌，其可以在环境不适宜的时候产生孢子，孢子可以抵御高温、干旱等极端环境，待环境适宜时再萌发进行营养生长。枯草芽孢杆菌的分泌能力强，在进行高密度发酵时，蛋白分泌量可以达到20—25g/L(DevelopmentsintheuseofBacillusspeciesforindustrialproduction，2004)。其发酵生产的蛋白酶、淀粉酶、次黄嘌呤核苷、核糖甙等产品，早已经进入我们的日常生活。由于其具有生物安全性，被FDA评为GRAS类添加剂，其生产的益生菌及利用其生产的发酵产品已广泛应用于医药和养殖业中。上世纪八十年代就开始利用枯草芽孢杆菌进行蛋白表达，其表达产物不仅包括细菌来源的各种酶类，如淀粉酶、蛋白酶、内葡聚糖酶、脂肪酶等，还包括hEGF、IFN-alpha2、Proinsulin、Streptavidin、cathelicidin-BF等不同来源的蛋白。利用枯草芽孢杆菌的分泌途径，可将表达蛋白分泌到发酵液中，极大地降低了后期分离纯化的难度。枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，不含有脂多糖，便于生产注射用药品。枯草芽孢杆菌的营养要求简单，由于其已经实现规模工业化生产，大规模培养技术成熟，培养成本低。目前，枯草芽孢杆菌中的多个菌株及芽孢杆菌属中的多个种都已经完成了基因组测序工作，遗传背景清楚，安全性高，也便于进行基因组改造。但是枯草芽孢杆菌表达系统并不是一个广泛应用的表达系统，还有许多缺点待克服。枯草芽孢杆菌的模式菌168菌的野生型菌株已经丢失，目前可以得到的菌株都是其突变体。尽管其满足于科学研究的要求，但是其蛋白分泌能力差，是营养缺陷性突变体的特性，并不能满足建立商业化表达系统的要求。目前建立的转化系统都是基于模式菌株168建立的，尽管野生型来源的菌株和已经生产应用的枯草芽孢杆菌种非常多，不易转化都阻碍了对这些菌株的进一步改造。枯草芽孢杆菌来源的质粒也几乎都是隐蔽性质粒，不易构建载体；来源于其它革兰氏阳性菌的质粒多数都是滚环复制性质粒，在枯草芽孢杆菌中复制不稳定，易丢失，拷贝数较少；这些特性都限制了直接使用质粒构建稳定表达系统的可能性。枯草芽孢杆菌有四种已知的分泌途径，Sec途径、Tat途径、Com系统和ABC转运途径，目前研究较清楚的是Sec途径，多数表达系统也利用Sec途径分泌表达蛋白。但是Sec途径具有内在调控机制，会抑制不正确折叠的蛋白分泌，而外源蛋白一般折叠较慢，折叠过程需要伴侣蛋白的参与，容易被Sec分泌途径降解，这导致只有极少数蛋白可以利用Sec途径进行分泌表达，且外源蛋白的表达量都比较低。枯草芽孢杆菌还会分泌多达八种蛋白酶到发酵液中，其同样会降解表达的目的蛋白。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法，其不依赖于信号肽或者特征结构，与现有的Sec途径、Tat途径、Com系统和ABC转运途径有本质上差异。当任一目的蛋白在细胞内大量表达，就可以通过这一途径大量分泌到细胞外，最大分泌量可以达到g/L级别。不仅克服了现有分泌途径分泌量低，通用性差的特点，还可以无选择性地将目的蛋白分泌到发酵液中，降低后期分离纯化的难度。解决以上技术问题的本专利技术中的一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于：所述目的蛋白在胞内大量积累，其就被大量分泌到发酵液中。所述目的蛋白在胞内表达量超过总蛋白的2％以上时，其将会被分泌到发酵液中，分泌量在占表达蛋白的50％以上。本专利技术中一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)构建缺失八个蛋白酶的芽孢杆菌菌种：敲除芽孢杆菌表达菌株的aprE、bpr、epr、mpr、nprB、nprE、wprA和vpr八个蛋白酶基因，避免目的蛋白分泌到发酵液中后，被枯草芽孢表达菌株分泌的蛋白酶降解掉；这八个蛋白酶为表达分泌蛋白酶到发酵液中的基因，去除后能改善发酵液中的蛋白降解情况。(2)克隆目的蛋白基因，根据表达系统的要求构建表达载体，并将表达载体转入缺失八个蛋白酶的芽孢杆菌菌株，获得表达目的蛋白的表达菌株；(3)对步骤(2)中的表达菌株进行诱导培养，即得分泌的目的蛋白。本专利技术通过表达系统胞内大量表达目的蛋白，如果目的蛋白在胞内大量积累，其就可以被大量分泌到发酵液中，且任一可以胞内大量表达目的蛋白的表达系统都能用于蛋白分泌表达。所述表达系统为使目的蛋白在胞内积累被大量分泌到发酵液中的表达系统。本专利技术所采用的表达系统为“无抗表达系统”，其克服了抗生素筛选标记基因易发生漂移，质粒表达系统不稳定，表达不可诱导表达量不高的缺点，为一种低背景可控诱导且高效表达的无抗表达系统。所述“无抗表达系统”的菌株构建过程，包括采用xylR基因、xylAB的启动子区域和T7RNA聚合酶基因的CDS片段替换Z12菌株的wprA蛋白酶基因，具体包括以下步骤：(1)PCR扩增wprA基因上游片段wprA-F和wprA基因下游片段wprA-R，全基因合成xylR操纵子的xylR基因启动子及CDS区域和xylAB的启动子区域，全基因合成T7RNA聚合酶基因的CDS片段，通过同源重组构建载体pBTS-T7RP；(2)转化pBTS-T7RP质粒进入Z12菌株，通过限制性培养和传代培养，分别在基因组的wprA-F和wprA-R两个片段处完成两次重组，得到不具有抗性的含有xylR-T7RP片段的菌株ZT7RP。本专利技术所采用的“无抗表达系统”的表达菌株ZT7RP，在菌株构建过程中已经敲除了wprA蛋白酶基因。本专利技术中构建缺失八个蛋白酶的芽孢杆菌菌株的方法，即分别构建pBTS-aprE、pBTS-bpr、pBTS-epr、pBTS-mpr、pBTS-nprB、pBTS-nprE和pBTS-vpr载体，逐次敲除ZT7RP菌株中的aprE、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于：所述目的蛋白在胞内大量积累，其就被大量分泌到发酵液中。

【技术特征摘要】
1.一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于：所述目的蛋白在胞内大量积累，其就被大量分泌到发酵液中。2.根据权利要求1所述的一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于：所述目的蛋白在胞内表达量超过总蛋白的2%以上时，其将会被分泌到发酵液中，分泌量占表达蛋白的50%以上。3.根据权利要求1或2所述的一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：（1）构建缺失八个蛋白酶的芽孢杆菌菌株：敲除芽孢杆菌表达菌株的aprE、bpr、epr、mpr、nprB、nprE、wprA和vpr八个蛋白酶基因，避免目的蛋白分泌到发酵液中后，被枯草芽孢表达菌株分泌的蛋白酶降解掉；（2）克隆目的蛋白基因，根据表...

【专利技术属性】
技术研发人员：任钧，唐旭，雷蕾，樊超，柴进凯，曹付明，范佳，曹镜，
申请(专利权)人：成都美溢德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51