利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法，通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L‑氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行修饰，使得rhsA基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L‑氨基酸，来生产L‑氨基酸。本发明专利技术通过一些列的试验验证，rhsA基因的缺失，其功能或者其相关序列的缺失，对于L‑氨基酸发酵有利，有助于氨基酸产量和转化率的提升。

The use of rhsA gene deletion strains by L amino acid fermentation production method

The invention discloses a method for using rhsA gene deletion strains by L amino acid fermentation production method, through the cultivation of Enterobacteriaceae in the medium, and has L amino acid production capacity of bacteria, the bacteria in the culture before modification, the rhsA gene deletion and amino acids from the medium or cells collected from L the bacteria to produce L amino acid. The present invention through the test series, the deletion of rhsA gene and its function or its related sequence deletion, for L amino acid fermentation favorable, helps to enhance the conversion rate and yield of amino acids.

【技术实现步骤摘要】
利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法
本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种通过发酵生产L-氨基酸的方法。
技术介绍
在工业上，目前L-氨基酸的生产方法主要为生物发酵法，即通过具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵来生产L-氨基酸，因此具有L-氨基酸生产能力菌株的获得是L氨基酸生产方法的核心。目前获得L氨基酸生产菌株的方法主要有两种，一种是通过对野生型微生物(野生型菌株)进行诱变的方法，使其具有营养缺陷，并使其对某些代谢物产生拮抗作用，从而获得优良的工业生产菌株。近年来随着基因工程技术的发展，重组DNA技术已经开始普遍应用于微生物代谢工程改造方面，使其成为另外一种重要的获得L-氨基酸生产菌株的方法。比如，通过提高目标产品合成途径中关键酶的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1305002A)；再比如，通过提高目标产品的分泌蛋白的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1260393A)；或者，通过降低某些基因的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1607246A)；在或者，通过敲除某些基因，使其失活，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1466630A)。rhs基因是一类广泛存在于大肠杆菌中的基因序列，其包含核心区域包含重复序列和不同的C末端序列。其家族包括rhsA，rhsB，rhsC，rhsD等。有研究表明，rhsA的过表达会造成细胞在稳定期生存能力下降。目前，对于rhsA功能的研究比较少，其对于L-氨基酸合成是否具有影响还没有相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，以提高L-氨基酸产量和转化率。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得rhsA基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。进一步的，采用rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA，通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。所述rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA通过下述方法构建得到：首先，制备菌株ATCC21151的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段rhsAknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA1-F/rhsA1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2转化ATCC21151ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA，至此L-苏氨酸生产所用的rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA构建完毕。进一步的，采用rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。所述rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA通过下述方法构建得到：首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，至此L-赖氨酸生产所用的rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA构建完毕。所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到：利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA；以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建dapA和lysC突变体过表达质粒，得到质粒pwsk-lysC*-dapA*；将质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655；获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。有益效果：本专利技术提供的方法，采用rhsA基因缺失的大肠杆菌菌株，通过发酵的方法生产得到L-氨基酸，并通过一些列的试验验证，rhsA基因的缺失，其功能或者其相关序列的缺失，对于L-氨基酸发酵有利，有助于氨基酸产量和转化率的的提升。附图说明图1为基因片段rhsAknock1的构建过程示意图；图2为基因片段rhsAknock2的构建过程示意图；图3为基因质粒pwsk-lysC-dapA的构建过程示意图。具体实施方式本专利技术实施例所用的L-苏氨酸生产菌株为大肠杆菌ATCC21151，来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(ATCC)。本专利技术实施例所用的L-赖氨酸生产菌株为大肠杆菌MG1655(ATCC47076)，来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(ATCC)。DNA聚合酶购自北京全式金公司的Fastpfu；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、硫酸铵等常用化学试剂均购自国药。质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，多片段重组试剂盒(MultiSOneStepCloningKit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司，相关操作均严格按照说明书执行；XL-Ⅱ定点突变试剂盒购自天津博鑫生物科技有限公司，相关操作均严格按照说明书执行；质粒构建测序验证和基因缺失测序工作由华大基因完成；DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉。抗生素浓度为：氨苄青霉素100ug/mL，卡那霉素30ug/mL，氯霉素15ug/ml。L-苏氨酸和L-赖氨酸检测方法：通过安捷伦液相仪，利用ZORBAXEclipseAAA(氨基酸分析)色谱柱对发酵液中的L-赖氨酸和L-苏氨酸进行分析，相关操作均严格按照说明书执行。葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。实施例1rhsA敲除片段的构建大肠杆菌基因敲除采用经典的Red重组方法，因此需要有进行重组的基因片段。相关基因片段构建方法如下：首先，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物rhsAup1-F/rhsAup1-R和rhsAdown1-F/rhsAdown1-R，见表1，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法，其特征在于：通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L‑氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得rhsA基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L‑氨基酸，来生产L‑氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得rhsA基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。2.根据权利要求1所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：采用rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA，通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。3.根据权利要求2所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA通过下述方法构建得到：首先，制备菌株ATCC21151的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段rhsAknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA1-F/rhsA1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2转化ATCC21151ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA，至此L-苏氨酸生产所用的rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA构建完毕。4.根据权利要求1所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：采用rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。5.根据权利要求4所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA通过下述方法构建得到：首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，至此L-赖氨酸生产所用的rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA构建完毕。6.根据权利要求5所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到：利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA；以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙会刚，李同祥，刘恩岐，高兆建，张传丽，崔珏，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32