The invention discloses a method for preparing recombinant EcoR restriction endonuclease V, which comprises the following steps: (1) expression plasmid pCreat Duet EcoR V methyltransferase; (2) expression and identification of EcoR V and methyltransferase protein; (3) purification and identification EcoR V and methyltransferase protein. Through the reorganization of EcoR V restriction endonuclease and methylase clone containing His tag pCreat Duet co expression vector, the expression reached 30% under the condition of low temperature. By Ni affinity chromatography and Superdex200 gel filtration chromatography to obtain high activity of recombinant EcoR restriction endonuclease V, specific activity and commercial enzyme similar.
【技术实现步骤摘要】
重组EcoRV限制性内切酶的制备方法
本专利技术涉及一种重组EcoRV限制性内切酶的制备方法。
技术介绍
限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列,并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶,简称限制酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型,分别是第一型(TypeI)、第二型(TypeII)及第三型(TypeIII)。第一型限制酶同时具有修饰及识别切割的作用;另有识别DNA上特定碱基序列的能力,通常其切割位距离识别位可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。第二型限制酶只具有识别切割的作用,修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列;所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上,实用性较高的限制酶种类。例如:BanHI、HindIII。第三型限制酶与第一型限制酶类似,同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列,切割位与识别序列约距24~26个碱基对。例如:HinfIII。II型限制与修饰系统所占的比例最大,达93%。其中II型酶相对来说最简单,它们识别回文对称序列,在回文序列内部或附近切割DNA,产生带3′-羟基和5′-磷酸基团的DNA产物,需Mg2+的存在才能发挥活性,相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4~6bp,或更长且呈二重对称的特殊序列,但有少数酶识别更长的序列或简并序列,切割位置因酶而异,有些是隔开的。本专利技术中的EcoRV限制性内切酶即属于II型限制酶其识别位点为:5’-GAT^ATC-3’5’-CTA^TAG-3’通过切割T与A之间的磷酸二酯键使3’端带有 ...
【技术保护点】
重组EcoR V限制性内切酶的制备方法,包括以下步骤:(1)表达质粒pCreat Duet‑EcoR V‑甲基化酶的构建;(2)EcoR V与甲基化酶蛋白的诱导表达与鉴定;(3)EcoR V与甲基化酶蛋白的纯化与鉴定。
【技术特征摘要】
1.重组EcoRV限制性内切酶的制备方法,包括以下步骤:(1)表达质粒pCreatDuet-EcoRV-甲基化酶的构建;(2)EcoRV与甲基化酶蛋白的诱导表达与鉴定;(3)EcoRV与甲基化酶蛋白的纯化与鉴定。2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)具体包括以下步骤:(4)EcoRV与甲基化酶的基因合成根据密码子优化后的基因序列,直接进行基因合成;(5)Gibson重组连接将pCreatDuet通过酶切进行线性化,线性化产物与步骤(4)的基因合成产物进行无缝克隆;(6)重组产物转化将上述重组连接产物20μL转移到TOP10感受态细胞中,冰上静置30min,42℃热激90s,冰上再静置2min;加入600ulLB液体培养基,37℃摇床200rpm摇45min,涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中,37℃培养箱培养过夜;(7)重组克隆的鉴定随机挑取至少4个单克隆,接入4mL含卡那霉素LB中;37℃摇床220rpm摇过夜,抽提质粒并测序。3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)具体包括以下步骤:(8)重组质粒转化大肠杆菌将上述鉴定为阳性的重组质粒pCreatDuet-EcoRV-甲基化酶转入感受态BL21(DE3)中,涂布于含卡那霉素的LB平板上,37℃倒置培养过夜;(9)IPTG诱导蛋白表达挑单克隆于含卡那霉素LB中,37℃摇床,220rpm培养过夜,以1∶100接过夜菌于4mL含卡那霉素LB板中,继续培养2.5h,OD600nm达到0.6~0.8时加入IPTG至0.5mM,于15℃过夜诱导蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员:李森,雍德祥,邹刚刚,王方平,
申请(专利权)人:通用生物系统安徽有限公司,
类型:发明
国别省市:安徽,34
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