本发明专利技术公开了一种抗原表位肽，其氨基酸序列含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或含有对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列。该抗原表位肽可以用于产生抗原呈递细胞、主要组织相容性抗原复合物或细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，还能应用于制备治疗如胶质瘤的癌症的药物中。
CDK5 epitope peptide and its application
The invention discloses an antigen epitope peptide, its amino acid sequence containing the amino acid sequence of SEQ ID No.2 or SEQ ID No.3 shown, or contains an amino acid sequence shown in SEQ ID or SEQ No.2 ID No.3 add, deletion or substitution of one or more amino acids formed amino acid sequence. The epitope peptide can be used to produce antigen presenting cells, major histocompatibility complex antigens or cytotoxic T lymphocyte inducers, and can also be used in the preparation of drugs for the treatment of glioma such as cancer.
【技术实现步骤摘要】
CDK5抗原表位肽及其应用
本专利技术属于分子免疫学领域，涉及抗原表位肽，具体涉及HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的CDK5表位肽及其应用。
技术介绍
胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤，复发率高，预后差。主要原因是肿瘤的残留病变难以消除。免疫治疗可以进一步清除手术、放化疗后的微小残留病灶，从而可以减少或避免胶质瘤的复发。但是寻找肿瘤相关抗原是肿瘤免疫治疗的关键，研究者不断筛选新的肿瘤相关抗原以最终达到针对每位患者个体化治疗的目的。研究显示，细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)在胶质瘤中高表达，并与PD-L1表达相关。下调或者抑制CDK5蛋白的表达会使胶质瘤细胞显著凋亡。本研究将CDK5蛋白作为胶质瘤免疫治疗的候选靶抗原，并以表位肽来替代蛋白质作为靶点。因此，本领域技术人员致力于开发一种HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别的CDK5表位肽。
技术实现思路
有鉴于现有技术中肿瘤特异性抗原的免疫原性不够强等问题，本专利技术提供了一种CDK5抗原表位肽及其应用。本专利技术的第一方面提供了一种CDK5抗原表位肽，其选自以下任一项：1)含有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，该肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。进一步地，上述抗原表位肽为SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的肽。本专利技术的第二方面提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码上述抗原表位肽的氨基酸序列。本专利技术的第三方面提供了一种抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞脉冲以上述抗原表位肽。本专利技术的第四方面提供了一种主要组织相容性抗原复合物，其包括HLA-A0201分子和上述抗原表位肽。本专利技术的第五方面提供了一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，该细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：1)如上所述的抗原表位肽；2)如上所述的抗原呈递细胞；或3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。本专利技术的第六方面提供了一种癌症疫苗，该癌症疫苗的活性成分包括：1)如上所述的抗原表位肽；2)如上所述的抗原呈递细胞；或3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。进一步地，上述癌症为胶质瘤。本专利技术还提供了上述抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。优选地，癌症为胶质瘤。本专利技术通过在线筛选、T2细胞亲和性和稳定性实验，筛选获得了两条目的抗原表位肽aa106和aa164。他们在健康供者及患者外周血中均存在，这为后续的研究供了必要条件。通过上述抗原表位肽，在专制抗原提呈细胞(如DC)的辅助下，激活CTL并使之扩增。激活后的CTL作用于CDK5蛋白来阻断免疫耐受及免疫忽视，提高其免疫原性，从而有效地杀伤胶质瘤细胞，但是其对正常造血细胞没有杀伤作用。据推测，在CDK5-CTL细胞下调了肿瘤细胞CDK5表达后，将会极大的恢复正常的活化T淋巴细胞的清除肿瘤作用。附图说明图1是本专利技术一个实施例的T2细胞亲和实验结果图。其中，阴性对照FLU-matrix为流感基质蛋白，阳性对照为HIVpol，aa106和aa164为两条预测的肽段。图2是本专利技术一个实施例的T2细胞结合稳定性实验结果图。图3是本专利技术的一个实施例的CDK5-CTL中CD8+的细胞的CD45RA表达情况结果图。图4是本专利技术的一个实施例的CDK5-CTL中CD8+的细胞的CD45RO表达情况结果图。图5是本专利技术一个实施例的CDK5-CTL增殖实验结果图。图6是本专利技术一个实施例的CDK5-CTL细胞杀伤实验结果图。图7是本专利技术一个实施例的CDK5-CTL细胞功能实验结果图。具体实施方式以下将结合实施例对本专利技术作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本专利技术的保护范围。以下具体实施方式中使用的试剂，如无特殊说明，均可直接购买获得。流式细胞仪购自BECKMANCOULTER，型号为Navios。T2细胞购自ADCC。FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2购自ebioscience。FITC标记的CD8+单克隆抗体购自ebioscience。多肽的合成可以通过现有技术中的任何方法进行，如固相肽合成法等。氨基酸的替换：通过氨基酸替换可以获得类似或等同活性的突变体肽，该替换可以用具有与替换前的氨基酸的电荷、可溶性、亲水性/疏水性、极性类似的氨基酸进行。T2细胞亲和性和稳定性分析的原理：T2细胞缺乏内源性抗原肽提呈中必须的抗原加工相关转运蛋白，其本身表面只有少量空载的HLA-A0201分子表达且极不稳定。但当其表面MHCI类分子与HLA-A0201结合力强的肽段结合后，HLA-A0201的表达情况会增强并稳定。并且，HLA-A0201分子和肽段的结合力越强，T2细胞表面的HLA-A0201分子降解就越少，表现为HLA-A0201分子的表达量越高。因此，可以直接用T2细胞表面HLA-A0201分子表达的强弱来反应所预测表位肽与HLA-A0201的结合能力。同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。实施例1：HLA-A0201限制性CDK5蛋白CTL表位肽预测及合成(1)CDK5蛋白氨基酸序列的确定：通过在Genbank数据库中查找CDK5蛋白序列，获得Genbank登录号为：CAG33322.1的一种CDK5蛋白序列，其由292个氨基酸残基组成，具体如SEQIDNo.1所示。(2)CDK5蛋白表位肽的在线预测：利用表位肽预测数据库a：https://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform及b：http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)提供的服务对HLA-A0201限制性CDK5蛋白表位肽进行初步预测，选择其中得分最高的数条表位肽，之后用超基序及量化基序方案对初步预测出的CTL表位肽进行修饰，以进一步提高积分。修饰后得分最高的两条表位肽如表1所示：表1CDK5蛋白表位肽与人HLA-A0201亲和力预测积分(得分Ia和得分IIb分别代表使用上方a网站和b网站各自预测的分数。(3)多肽的合成、纯化与鉴定：通过生物合成手段，合成、纯化及鉴定了表1中的两个肽段aa106和AA164(上海波泰生物科技公司)。(4)对照肽：选取文献报道中的HLAA0201阳性肽和阴性肽作为对照。这两条肽分别为：阳性肽HIVpol：ILKEPVHGV(SEQIDNo.4)；阴性肽：流感病毒基质蛋白肽段(FLU-matrix肽段)：GILGFVFTL(SEQIDNo.5)。实施例2：T2细胞表位肽结合亲和及稳定性实验借助T2细胞的特性进行HLA-A0201与肽段的亲和能力及稳定性测定。(1)T2细胞亲和实验收集T2细胞，用4℃的无菌PBS离心洗涤三次，加入无血清1640培养基，2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种CDK5抗原表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA‑A0201分子形成复合物而被HLA‑A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA‑A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。
【技术特征摘要】
1.一种CDK5抗原表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：1)含有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。2.如权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽为SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的肽。3.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1中所述的抗原表位肽的氨基酸序列。4.一种抗原呈递细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞脉冲...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙媛，陈书艳，王飞，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属新华医院，
类型：发明
国别省市：上海,31
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