一种热启动Taq酶的制备方法技术

本发明专利技术公开一种实时热启动Taq酶及其制备方法，所述的热启动Taq酶是Taq酶和Taq酶纳米抗体通过抗原抗体反应形成的抗原抗体复合物，所述的Taq酶纳米抗体的来源包括但不限于通过Taq酶免疫可产生纳米抗体的动物得到。通过形成Taq酶抗原抗体复合物，使得Taq酶在较高的温度下才能得以释放活性，实现热启动，使Taq酶的特异性、可靠性和灵敏度得到提升，避免了非特异性扩增的发生，对比同类产品，能很大程度上减少克隆错配，实现高效特异扩增。且纳米抗体具有高亲和力和高稳定性，可大大提高热启动PCR的特异性、灵敏性和扩增效率，适用于各类PCR反应。

Method for preparing heat activated Taq enzyme

The invention discloses a real-time hot start Taq enzyme and a preparation method thereof, wherein the hot start Taq enzyme is the antigen antibody complex Taq and Taq enzyme formed by nano antibody antigen antibody reaction, enzyme source Taq nano the antibodies including but not limited to by Taq enzyme immunoassay can produce nano antibody animal get. Through the formation of Taq enzyme antigen antibody complexes, the Taq enzyme at high temperature to be released to achieve hot start, the activity of Taq enzyme specificity, sensitivity and reliability are improved, avoiding the non-specific amplification occurs, compared to similar products, can largely reduce the mismatch to achieve efficient cloning, specific amplification. Moreover, the high affinity and high stability of the nano antibody can greatly improve the specificity, sensitivity and amplification efficiency of the heat activated PCR, and is suitable for various PCR reactions.

【技术实现步骤摘要】
一种热启动Taq酶的制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种Taq酶的制备方法，特别是一种热启动Taq酶的制备方法。
技术介绍
聚合酶链锁反应(PCR)，是一种生物体外扩增特定DNA片段的技术，是目前分子生物学和医学领域的重要工具。PCR使用的DNA聚合酶主要是Taq酶，随着PCR技术的推广和应用，对Taq酶性质的研究日渐重要。Taq酶是一种耐热的DNA聚合酶，从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)中分离得到。该酶具有热稳定性，但在20℃～37℃下仍有一定聚合酶活性，容易产生非特异性的扩增及产生引物二聚体。为解决这些问题，人们专利技术了热启动PCR，通过多种途径提高Taq酶的最适反应温度，达到PCR反应热启动的目的，以最大程度地减少非特异性的扩增。常用的热启动PCR有以下几种方式：化学封闭法，需预加热，易损伤DNA；肝素盐法，需预加热，易损伤DNA；物理隔绝法，易对扩增产物造成污染；单链DNA结合蛋白抑制法，多次高低温循环易使肽键断裂；肽抑制法，多次高低温循环易使肽键断裂。此外，中国专利申请201610737135公开了一种利用Taq酶与其ssDNA适配子结合达到热启动PCR的方法。该方法通过SELEX技术筛选与Taq酶具有亲和性的ssDNA适配子。但是，与抗体相比，高亲和性的ssDNA适配子尚未被广泛筛选出来，亲和力不高，势必会影响热启动PCR的特异性。抗原抗体结合抑制法也是一种常见的途径来提高Taq酶的最适反应温度。用Taq酶免疫实验动物获得抗Taq酶的单抗或者多抗。通过此方法，在PCR反应中，低温下酶与抗体形成抗原抗体复合物，使得聚合酶暂时失活；而在较高温度下时，抗体变性，使得Taq酶得以释放发挥活性，从而实现热启动。常规的抗原抗体结合抑制法同样具有多次高低温循环易使肽键断裂导致抗体失活的缺点。但是，随着抗体技术的发展，小型抗体不断出现。其中，单域抗体是指保留了较好的抗原结合能力和专一性的重链可变区(VH)小分子抗体片段。科学家发现，亚洲的西亚骆驼、非洲的单峰驼、南美洲的大羊驼、原驼、羊驼和小羊驼等偶蹄目胼足亚目骆驼科动物的抗体天然缺失轻链，从其重链可变区克隆得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为单域重链抗体(VHH)，是最小的功能性抗原结合片段，又可称作纳米抗体(Nanobody)。由于独特的分子结构和理化性质，与普通抗体相比，纳米抗体体积小、亲和力高、对热和PH有较强的抵抗力；与常规单域抗体相比也具有更好的构象稳定性。因此，利用Taq酶和Taq酶纳米抗体形成抗原抗体复合物，能大大提高PCR扩增效率和特异性，达到热启动PCR的目的。曾有硕士学位论文描述了从羊驼天然噬菌体文库中采用生物亲和淘选的方法获取Taq酶纳米抗体，再结合分子克隆技术，表达和纯化Taq酶纳米抗体的方法(唐笑.耐热DNA聚合酶的定点诱变及应用于热启动PCR的纳米抗体的淘选.南昌,南昌大学,2015)。该方法筛选得到了自制Taq酶的5个纳米抗体，外源表达仅得到了3个可溶性的纳米抗体。将这3个可溶性纳米抗体进一步纯化后，ELLISA鉴定发现仅1个纳米抗体与自制Taq酶有高亲和力，但并未结合在Taq酶活性中心，发挥不了阻止酶活性的作用，不能应用于热启动PCR。总之，通过生物亲和淘选获得Taq酶纳米抗体的方法存在特异性差、亲和力不高等问题，成功率低，实用性差。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种实时热启动Taq酶及其制备方法，以解决PCR反应中易出现克隆错配、非特异性扩增的问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是提供一种热启动Taq酶及其制备方法。一个方面，本专利技术提供了一种热启动Taq酶，所述的热启动Taq酶是Taq酶和Taq酶纳米抗体通过抗原抗体反应形成的抗原抗体复合物。所述的Taq酶纳米抗体的来源包括但不限于通过Taq酶免疫可产生纳米抗体的动物得到。另一个方面，本专利技术提供了一种热启动Taq酶的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：(1)获得Taq酶；(2)制备Taq酶纳米抗体：将步骤(1)得到的Taq酶作为抗原，加入佐剂，注射免疫可产生纳米抗体的动物，待抗体产量稳定时停止免疫，采血分离得到抗血清，测定抗血清的特异性和效价后，分离纯化抗血清，得到抗Taq酶的纳米抗体；(3)制备热启动Taq酶：步骤(1)得到的Taq酶与步骤(3)得到的Taq酶纳米抗体，按比例在30～40℃孵育1～2h，使抗原抗体形成复合物，即得到热启动Taq酶。进一步地，步骤(1)中Taq酶的获得方法可以为商业途径获得、通过来源生物分离纯化、基因重组技术制备等。进一步地，步骤(2)中可产生纳米抗体的动物包括但不限于骆马、羊驼、小羊驼、亚洲的西亚骆驼、非洲的单峰驼、南美洲的大羊驼、原驼。进一步地，步骤(2)中所用佐剂包括但不限于费氏佐剂。进一步地，步骤(2)中抗血清的分离纯化方法可以为亲和层析法、吸附剂法等。进一步地，步骤(3)中所述Taq酶与Taq酶纳米抗体的比例为摩尔比为0.9～1.1。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)通过形成Taq酶抗原抗体复合物，在PCR反应中实现热启动，使Taq酶的特异性、可靠性和灵敏度得到提升，对比同类产品，能很大程度上减少克隆错配，适用于各类PCR反应。(2)本专利技术用于形成Taq酶抗原抗体复合物的所使用的抗体不同于普通抗体，其为纳米抗体，具有体积小、亲和力高、对热和PH有较强的抵抗力、构象更稳定的特点。且通过直接免疫可得到纳米抗体的动物的方法制备得到的Taq酶纳米抗体，特异性强，纯度高，亲和力高。凭借以上特点，Taq酶和Taq酶纳米抗体所形成的抗原抗体复合物能大大提高基因扩增的特异性、灵敏性和扩增效率。综上，本专利技术提供了一种通过形成Taq酶和Taq酶纳米抗体复合物，制备热启动Taq酶的方法，可实现热启动PCR的目的。且由于使用的是纳米抗体，其高亲和力和高稳定性，可大大提高热启动PCR的特异性、灵敏性和扩增效率。(3)利用本专利技术所述的方法，通过免疫骆马制备的热启动Taq酶，与免疫羊驼、小羊驼等其他可产生纳米抗体的动物制备的热启动Taq酶相比，抗冻融能力相对最强，耐低温保存能力也相对最强，实用性更高。附图说明图1为本专利技术实施例1制备的热启动Taq酶用于PCR反应的扩增结果和阴性对照组扩增结果。1表示本专利技术实施例1制备的热启动Taq酶的扩增曲线；2表示阴性对照组扩增曲线。图2为本专利技术实施例2制备的热启动Taq酶与商业rTaq酶、商业热启动Taq酶实验效果比对图。1表示本专利技术实施例2制备的热启动Taq酶的扩增曲线；2表示商业热启动Taq酶的扩增曲线；3表示商业rTaq酶的扩增曲线。具体实施方式以下实施例的说明只是用于帮助理解本专利技术的方法及其核心思想。应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以对本专利技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本专利技术权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本专利技术。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本专利技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本专利技术将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热启动Taq酶，其特征在于：所述的热启动Taq酶是Taq酶和Taq酶纳米抗体通过抗原抗体反应形成的抗原抗体复合物。

【技术特征摘要】
1.一种热启动Taq酶，其特征在于：所述的热启动Taq酶是Taq酶和Taq酶纳米抗体通过抗原抗体反应形成的抗原抗体复合物。2.如权利要求1所述的热启动Taq酶，其特征在于：所述的Taq酶纳米抗体是通过Taq酶免疫可产生纳米抗体的动物得到。3.一种权利要求1所述的热启动Taq酶的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：(1)获得Taq酶；(2)制备Taq酶纳米抗体；(3)将步骤(1)获得的Taq酶和步骤(2)获得的Taq酶纳米抗体，按比例孵育，即得到热启动Taq酶。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的获得Taq酶包括商业途径获得、通过来源生物分离纯化、基因重组技术制备。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的Taq酶和Taq酶纳米抗体的比例为摩尔比为0.9～1.1。6.如权利要求3所述的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：林志豪，张晓玮，彭春梅，张嘉，邓可基，李海茵，谢丽娟，李家导，乐小炎，罗园香，张新，陈观芝，陈凤英，林敏深，石壮壮，林若琳，王星，王法，余培煜，莫静嫣，
申请(专利权)人：广州海力特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44