Klenow酶及其表达纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种Klenow酶及其表达纯化方法，通过对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(Klenow酶)的裂解液。在进行Ni离子亲和柱纯化之前，向裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，然后向聚合沉降反应后收集的上清液中加入蛋白沉淀剂盐析沉降目的蛋白，从而得到粗产物。粗产物中核酸残留少、杂质少，对Ni离子亲和柱纯化过程的影响较小。这种表达纯化的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，表达纯化获得的Klenow酶纯度高，满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

Klenow enzyme and its expression and purification method

The present invention relates to a Klenow enzyme and its expression and purification method. The recombinant engineering bacteria containing Klenow enzyme fragments are induced to culture, and the bacteria after induction culture are collected. The lysate was then cleaved to obtain a lysate containing the target protein (Klenow). Before the Ni ion affinity column purification, adding cationic polymer to lysis solution polymerization of the precipitation reaction by precipitating protein, protein and collecting the supernatant salting out sedimentation to the polymerization reaction after the settlement, in order to get the crude product. The residues of nucleic acid in crude products are less and less impurities, which have less influence on the purification process of Ni ion affinity column. The method of expression and purification is simple, fast, low cost and suitable for mass production. The purity of Klenow enzyme obtained by expression and purification is high, which meets the requirement of two generation sequencing for purity of Klenow enzyme.

【技术实现步骤摘要】
Klenow酶及其表达纯化方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种Klenow酶及其表达纯化方法。
技术介绍
Klenow酶(又称Klenow片段、克列诺片段或称克列诺酶，英文名为Klenowfragment或Klenowenzyme)，是DNA聚合酶Ⅰ的大片段。Klenow酶由汉斯·克列诺于1970年用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ时，水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。Klenow片段保留了DNA聚合酶I的5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，但缺少完整酶的5’-3’外切酶活性，常用于填补DNA单链末端成为双链。随着二代测序的发展与应用，Klenow酶作为二代测序建库的工具酶具有很高的市场价值。现阶段大部分的Klenow酶文献报道都停留在蛋白性质研究，通常是重组表达后进行纯化。一般的Klenow酶的纯化工艺需要经过破菌、硫酸铵盐析、MonoQ离子交换、phenyl疏水层析、Superose12凝胶层析、超滤以及透析共九步，该工艺比较繁琐，得率低，不适用于大规模工业化生产。有研究将纯化工艺缩短至破菌、多次重复硫酸铵盐析、NI-NTA、Sephacryl200凝胶层析五部，多次重复硫酸铵盐析对终产品纯度、比活及回收率上均有一定的提高，但纯度仍然无法满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。综上，传统的方法表达纯化的Klenow酶纯度较低，难以满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种纯度较高的Klenow酶及其表达纯化方法。一种Klenow酶的表达纯化方法，包括以下步骤：对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集所述诱导培养后的菌体；将所述菌体裂解，得到裂解液；向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，固液分离后收集上清液；向所述上清液中加入蛋白沉淀剂，盐析沉降后得到粗产物；以及利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物，得到所述Klenow酶。在一个实施方式中，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与所述裂解液的质量比为0.1～1:100。在一个实施方式中，所述向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应的操作包括：将所述阳离子聚合物溶解在溶剂中，配制形成阳离子聚合物溶液；以及将所述阳离子聚合物溶液滴加到所述裂解液中，并搅拌混匀。在一个实施方式中，还包括构建所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌的操作：以Klenow酶的基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中，所述上游引物带有EcoRI酶切位点，所述下游引物上带有Hindlll酶切位点；将所述PCR扩增产物用EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，得到所述Klenow酶表达片段；将所述Klenow酶表达片段插入到经过EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理后的表达载体中，得到重组载体；以及将所述重组载体转入基因工程菌中，得到所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌。在一个实施方式中，所述Klenow酶的基因编码序列的碱基序列如SEQIDNo.1所示，所述上游引物的碱基序列如SEQIDNo.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQIDNo.3所示。在一个实施方式中，所述将所述菌体裂解，得到裂解液的操作包括：用裂解缓冲液重悬所述菌体，得到重悬液，其中所述裂解缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA和终浓度为40mmol/L～60mmol/L的NaCl，所述裂解缓冲液与所述菌体的体积比为2～10：1；以及对所述重悬液进行超声破碎，固液分离收集上清，得到所述裂解液。在一个实施方式中，所述利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物的操作包括：将所述粗产物溶解在结合缓冲液中，加入到所述Ni离子亲和柱中，所述结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris和终浓度为300mmol/L～600mmol/L的NaCl，所述结合缓冲液与所述粗产物的体积比为2～5：1；用浓度梯度的咪唑溶液洗涤所述Ni离子亲和柱，收集含有Klenow酶的洗脱液。在一个实施方式中，所述收集含有Klenow酶的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对所述含有Klenow酶的洗脱液进行缓冲液置换，所述平衡缓冲液中含有终浓度为30mmol/L～50mmol/L的Tris、终浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA和终浓度为1mmol/L～5mmol/L的DTT。一种Klenow酶，通过上述任一项所述的Klenow酶的表达纯化方法制备获得。在一个实施方式中，编码所述Klenow酶的碱基序列如SEQIDNo.1所示。上述Klenow酶的表达纯化方法，通过对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(Klenow酶)的裂解液。在进行Ni离子亲和柱纯化之前，向裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，通过阳离子聚合物中和或吸附裂解液中核酸等阴离子物质，固液分离后收集上清液中核酸等阴离子的物质残留较少。然后向聚合沉降反应后收集的上清液中加入蛋白沉淀剂沉降目的蛋白，从而得到粗产物。粗产物中核酸残留少、杂质少，对Ni离子亲和柱纯化过程的影响较小，再用Ni离子亲和柱纯化粗产物，除去杂蛋白，提高Klenow酶的纯度。这种表达纯化的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，表达纯化获得的Klenow酶纯度高，满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。附图说明图1为一实施方式的Klenow酶的表达纯化方法的流程图；图2为实施例1表达纯化Klenow酶的过程中各阶段的样品的SDS-PAGE电泳结果比对图；图3为实施例1中在Ni-NTA柱纯化前后的样品的SDS-PAGE电泳结果比对图；图4为实施例1制备的Klenow酶与NEB对照酶的SDS-PAGE的比活电泳结果比对图；图5为实施例1制备的Klenow酶DNA内切酶活性检测的琼脂糖凝胶电泳结果比对图；图6为实施例1表达纯化Klenow酶的过程中各阶段的样品中大肠杆菌核酸残留检测的琼脂糖凝胶电泳结果比对图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。请参阅图1，一实施方式的Klenow酶的表达纯化方法，包括以下步骤S110～S190。S110、以Klenow酶的基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中，上游引物带有EcoRI酶切位点，下游引物上带有Hindlll酶切位点。具体地，Klenow酶的基因编码序列可以从基因数据中筛选获得。本实施方式中，Klenow酶的基因编码序列选自大肠杆菌的基因组。具体地，上游引物带有EcoRI酶切位点，下游引物上带有Hindlll酶切位点，便于酶切PCR扩增产物从本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集所述诱导培养后的菌体；将所述菌体裂解，得到裂解液；向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，固液分离后收集上清液；向所述上清液中加入蛋白沉淀剂，盐析沉降后得到粗产物；以及利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物，得到所述Klenow酶。

【技术特征摘要】
1.一种Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集所述诱导培养后的菌体；将所述菌体裂解，得到裂解液；向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，固液分离后收集上清液；向所述上清液中加入蛋白沉淀剂，盐析沉降后得到粗产物；以及利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物，得到所述Klenow酶。2.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与所述裂解液的质量比为0.1～1:100。3.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应的操作包括：将所述阳离子聚合物溶解在溶剂中，配制形成阳离子聚合物溶液；以及将所述阳离子聚合物溶液滴加到所述裂解液中，并搅拌混匀。4.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，还包括构建所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌的操作：以Klenow酶的基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中，所述上游引物带有EcoRI酶切位点，所述下游引物上带有Hindlll酶切位点；将所述PCR扩增产物用EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，得到所述Klenow酶表达片段；将所述Klenow酶表达片段插入到经过EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理后的表达载体中，得到重组载体；以及将所述重组载体转入基因工程菌中，得到所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌。5.根据权利要求4所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述Klenow酶的基因编码序列的碱基序列如SEQIDNo.1所示，所述上游引物的碱基序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，钟淑瑶，章瑞程，邓艳华，
申请(专利权)人：菲鹏生物股份有限公司，广东菲鹏生物有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44