CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA，其靶序列如SEQ ID NO:1～4中任一条序列所示。本发明专利技术还公开了包含有上述sgRNA的金黄色葡萄球菌CRISPR/SaCas9系统，以及用该系统特异性敲除人CXCR4基因的方法。本发明专利技术通过将特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA与AAV‑CRISPR/SaCas9质粒连接成载体，包装成AAV感染细胞，简便、高效、特异地实现了CXCR4基因的敲除，从而有效解决了使用SpCas9靶向CXCR4进行艾滋病治疗的局限性。

CRISPR/SaCas9 specific knockdown method of human CXCR4 gene

The invention discloses a method for specific targeting CXCR4 gene sgRNA, the target sequence of SEQ ID NO:1 ~ 4 in any sequence shown. The present invention also discloses a Staphylococcus aureus CRISPR/SaCas9 system comprising the sgRNA, and a method for specifically knocking out the human CXCR4 gene with the system. The specific targeting of human CXCR4 gene sgRNA and AAV connected into CRISPR/SaCas9 plasmid vector, packaged into AAV infected cells, simple and efficient, specifically the CXCR4 gene knockout, which effectively solve the SpCas9 target to the limitations of AIDS treatment to CXCR4.

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及基于金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9(CRISPR/SaCas9)系统特异性敲除人CXCR4基因的方法，以及用于特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)归属于逆转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属反转录病毒的一种，又称为艾滋病毒，其感染引起的获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)又称艾滋病，是一种危害性极大的传染病。自发现的三十多年来，AIDS已累计导致两千余万人死亡，一直是一个巨大的公众健康难题，影响着全球3,530万人的生活。HIV可分为HIV-1和HIV-2两种亚型，HIV-1的致病力强，是引起艾滋病的主要病原体。CD4+T细胞是HIV-1病毒感染过程的首要靶点。随后研究又发现仅有CD4分子并不能介导HIV-1病毒的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体(coreceptor)。1996年证实，趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-1病毒感染的辅助受体。T细胞向性X4HIV-1使用CD4和CXCR4进入细胞，而巨噬细胞向性R5HIV-1使用CD4和CCR5。双向性的毒株能使用CXCR4和CCR5作为共受体。其他趋化因子受体中的CCR3、CCR2、CCR8、CXCR6、CXCR7、CX3CR1能作为更限制亚群的HIV株的共受体发挥作用。目前对艾滋病的治疗手段主要是控制HIV-1病毒的感染以及阻碍AIDS的发展，称为高效抗逆转录病毒治疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)，包括一系列抑制病毒各个繁殖阶段的化合物。HAART是能很大程度上减少细胞内病毒的繁殖和血浆病毒血症的发生，但对于新的宿主细胞不被HIV-1感染没有作用。为了从源头上预防健康的细胞被HIV-1感染，新的治疗方案需要彻底地破坏病毒的入侵途径，因而以CCR5和CXCR4为靶点的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注，主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等。如SDF-1(CXCR4的天然配体)以及CCR5的CCL3、CCL4、CCL4-L1和CCL5配体能够抑制不同株HIV-1引起的细胞融合和感染。尽管辅助受体拮抗剂可有效预防HIV-1感染，遏制艾滋病的流行，但是此类抑制剂的发展也面临着挑战。长期使用一种抑制剂，最终会使HIV-1产生耐药性。随着耐药性的不断出现，使得现有的抗HIV-1药物难以达到理想的治疗效果。因此，从基因组层面失活CCR5或CXCR4具有重要的治疗价值。2008年，Sangamo成功的利用Engineeredzincfingernucleases(ZFNs)在CD4+T细胞上实现CCR5的敲除。如今这项名为SB-728-T的项目已被尝试应用于HIV感染人群的基因治疗，并已进入临床二期阶段。这一基因编辑产品通过敲除分离到病人的CD4+T细胞的CCR5，然后自体回输到病人，可以用于HIV感染的治疗。但如前面所提及的CCR5受体是巨噬细胞向性R5HIV-1的主要共受体，而T细胞向性X4HIV-1的主要共受体是CXCR4，敲除CCR5并不能治疗被双向性HIV-1感染的患者或者被T细胞向性X4HIV-1感染的患者。因此，通过基因层面敲除CXCR4在X4-向性和双向性HIV感染的患者中扩展此类治疗有明确的医学需求。规律成簇间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR-associated，CRISPR/Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，是细菌和古细菌在进化过程中形成的一种免疫防御体系，用以对抗外来病毒和外源DNA入侵。CRISPR/Cas9系统通过整合外源DNA片段到CRISPR中，利用CRISPRRNA(CRISPR-derivedRNA，crRNA)和反式作用RNA(trans-activatingRNA，tracrRNA)特异性地识别靶向序列，并对序列靶位点进行切割。在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologousendjoining，NHEJ)，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或缺失(Indel)，造成移码突变，导致基因敲除。或者是在有同源模板的情况下，可通过另一条同源重组(homologousrecombination，HR)的修复途径进行修复，可实现对靶向基因的精确编辑，如引入特异突变或定点转基因。现在已经把两种小RNA(crRNA和tracrRNA)融合成一条RNA链，简称sgRNA(singleguideRNA)，因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA也成为CRISPR/Cas9基因敲除的关键。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。研究人员优先选择改造了来自化脓链球菌的Cas9酶(StreptococcuspyogenesCas9,SpCas9)来改变高等生物的DNA，并已成为一系列高度通用的基因组修饰技术的基础。最近的一些研究利用CRISPR/SpCas9系统在CD4+T细胞或者CD34+干细胞对艾滋病毒的辅助受体CCR5进行基因修饰，在一定的程度上可以抑制HIV-1病毒的侵入，但是也存在着一定的脱靶率。最近发现了一种新的CRISPR/Cas9系统，它是一种是来自金黄色葡糖球菌的Cas9酶(StaphylococcusaureusCas9,SaCas9)，其基因敲除效率与之前的CRISPR/SpCas9系统相当，但是其大小却减少了25％。腺相关病毒(AAV)是基因治疗的最佳载体，但是由于其负载能力有限，使其包装SpCas9酶和其他必须的基因元件进入单个病毒颗粒存在一定的难度，而SaCas9的出现为这一问题的解决带来了新的希望。SaCas9与SpCas9存在着不同之处，SaCas9主要识别5’-NNGRRT-3’特征区域的NGGRRT位点，然后对与sgRNA互补的DNA序列进行剪切，被剪切后断裂的DNA双链通过非同源末端直接连接(non-homologousendjoining，NHEJ)或者同源重组(homology-directedrepair，HDR)的修补方法进行修复，修复后的DNA会由于某些碱基的随机插入、缺失、突变等使基因的序列发生改变从而抑制了基因的表达，由此在DNA水平上对基因进行定向敲除。而SpCas9的识别位点为PAM序列5’-NGG-3’，然后再对靶位点进行剪切。使用SpCas9靶向CXCR4进行艾滋病治疗，存在以下问题：1)SpCas9基因较大，不能方便地利用AAV载体进行基因治疗；2)SpCas9在靶向精确性上有所不足。SaCas9与SpCas9相比具有很多优点：1)SaCas9在哺乳动物体内具有很高的剪切效率，其所带有的sgRNA的长度范围为21-23个碱基，其本身的大小比SpCas9小25％本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID NO:1～4所示序列中的任意一条序列。

【技术特征摘要】
1.用于特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQIDNO:1～4所示序列中的任意一条序列。2.根据权利要求1所述的用于特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示。3.CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法，该方法用于非诊断和治疗目的，其特征在于，步骤包括：1)在权利要求1或2所述的sgRNA的靶序列的5’端加上用于形成粘性末端的序列，得到正向寡核苷酸；在权利要求1或2所述的sgRNA的靶序列的互补链的两端加上用于形成粘性末端的序列，得到反向寡核苷酸；合成所述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，变性、退火，形成带有粘性末端的双链sgRNA寡聚核苷酸；2)线性化腺相关病毒载体AAV-CRISPR/SaCas9，将所述双链sgRNA寡聚核苷酸连入线性化的AAV-CRISPR/SaCas9载体，转化感受态细胞，筛选获得阳性克隆，摇菌，抽提质粒；3)将步骤2)提取的含有所述双链sgRNA寡聚核苷酸的AAV-CRISPR/SaCas9载体包装成腺相关病毒；4)用步骤3)包装的腺相关病毒感染目的细胞，培养，收集被感染的目的细胞，进行酶切检测和克隆测序，确定CXCR4基因的敲除效率，并获得基因敲除的细胞。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨通，刘佩，欧恩智，陈珺，朱智，
申请(专利权)人：上海捷易生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31