本发明专利技术公开了一种特异靶向拟南芥ILK2基因的sgRNA序列及其应用；所述sgRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术根据sgRNA导向序列设计合成两条单链oligo DNA序列，退火形成双链，与Cas9载体连接，利用农杆菌介导的遗传转化技术，将sgRNA编码序列和CRISPR系统引入拟南芥中，Cas9蛋白会在sgRNA的引导下剪切目标序列，实现ILK2基因的敲除。本发明专利技术提供的sgRNA序列，可通过CRISPR‑Cas9系统敲除或编辑ILK2基因，以解析拟南芥ILK2基因的功能。
SgRNA sequence of specific target Arabidopsis thaliana ILK2 gene and application thereof
The invention discloses a specific target sgRNA sequence of ILK2 gene from Arabidopsis thaliana and its application; the nucleotide sequence of the sgRNA sequence is shown as SEQ ID NO.1. According to the sgRNA sequence oriented design and synthesis two monocatenarian oligo DNA sequence, annealed to form double chains, connected with Cas9 vector by Agrobacterium mediated genetic transformation technologies, the sgRNA encoding sequence and CRISPR system into the Arabidopsis Cas9 protein in sgRNA under the guidance of cutting target sequence, ILK2 gene knockout. The sgRNA sequence provided by the invention, through the CRISPR Cas9 system knockout or edit the ILK2 gene in Arabidopsis ILK2 gene function analysis.
【技术实现步骤摘要】
特异靶向拟南芥ILK2基因的sgRNA序列及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体而言，涉及一种特异靶向拟南芥ILK2基因的sgRNA序列及其应用。
技术介绍
ZFN、TALEN和CRISPR基因打靶技术是基因编辑的核心技术，相比于前两种技术繁琐的构建程序，比如每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，并且高度依赖目标上下游序列，CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的sgRNA的引导，sgRNA区可以由一系列针对不同基因的多个sgRNA组成，每个针对特异位点的sgRNA只有二十个碱基，整个载体较小，CRIEPR载体更加容易构建，其基因编辑也更加高效。CRISPR/Cas9原是细菌和古细菌应对外源病毒侵害的防御系统，现已广泛应用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、水稻等进行基因改造。它由导向序列sgRNA和核酸酶Cas9两种元件组成，sgRNA可通过碱基互补识别基因组中特定序列从而引导核酸酶Cas9对其进行切割造成双链DNA断裂(Double-strandbreaks，DSB)，当宿主细胞通过非同源重组方式进行修复，发生非同源重组末端连接(Non-homologousendjoining，NHEJ)，就可能造成移码突变(frameshiftmutation)，导致基因沉默(MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science.Congetal.2013)。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，但是，随后的研究发现，该系统也存在一定的局限性，就是在非目标区域会产生DNA的突变即脱靶效应，这在一定程度上阻碍了该技术的广泛应用(High-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbyCRISPR-Casnucleasesinhumancells.NatureBiotechnology.Fuetal，2013；High-throughputprofilingofoff-targetDNAcleavagerevealsRNA-programmedCas9nucleasespecificity.NatureBiotechnology.Pattanayaketal，2013)。麻省理工学院张峰团队使用双切刻技术将Cas9的特异性提高了50倍以上，稳固了Cas9在基因打靶
的地位(DoublenickingbyRNA-guidedCRISPRCas9forenhancedgenomeeditingspecificity.Cell.Ranetal，2013)。借助于这一技术，动植物基因功能研究及育种等领域都将得到迅猛的发展。精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性沉默目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性沉默。因此，设计、制备出特异性靶向目标基因序列的sgRNA成为了CRISPR-Cas9基因沉默技术的关键。拟南芥基因ILK2编码蛋白属于整合素连接蛋白激酶家族，具有丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶活性。能与MAPK、PKB、GSK3等多条信号通路和细胞骨架蛋白相互作用，参与调控细胞周期G1/S/G2期，抑制细胞凋亡等过程。在拟南芥中相关家族蛋白参与多种生物与非生物逆境，在介导细胞内环境稳态和植物免疫等方面有重要作用(TheRaf-likeKinaseILK1andtheHighAffinityK+TransporterHAK5AreRequiredforInnateImmunityandAbioticStressResponse.Plantphysiology.Elizabethetal，2016)。因此，在基因组水平上对拟南芥整合素连接蛋白激酶家族相关基因进行敲除或修饰，有助于解析相关基因的功能，为农作物抗性育种提供理论支持和实践参考。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异靶向拟南芥整合素连接蛋白激酶家族基因ILK2的sgRNA导向序列及其应用。本专利技术利用编码这种sgRNA序列的DNA构建植物表达载体，该表达载体能够表达出这种sgRNA，这种sgRNA能够特异性地识别拟南芥ILK2基因。本专利技术还利用这对sgRNA引导Cas9核酸酶(即Cas9切割酶)对拟南芥ILK2基因进行准确、高效地靶向修饰。具体地，本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术的目的是提供一种敲除拟南芥ILK2基因的方法，提供了敲除拟南芥ILK2基因的sgRNA，及用于敲除拟南芥ILK2基因的载体。本专利技术的敲除拟南芥ILK2基因的sgRNA序列，其序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的用于编码本专利技术的敲除拟南芥ILK2基因的sgRNA的DNA序列，所述DNA序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的用于敲除拟南芥ILK2基因的载体，所述载体为含有能表达特异性靶向ILK2基因第一外显子的sgRNA的DNA序列(序列如SEQIDNO.2所示)和Cas9蛋白DNA序列的植物表达载体。优选的，sgRNA的DNA序列上游为拟南芥U6启动子，Cas9蛋白DNA序列上游为拟南芥U1启动子，筛选标记为潮霉素抗性。本专利技术的靶向敲除拟南芥ILK2基因的载体构建方法，按以下步骤进行：(1)确定ILK2基因的合适的靶标序列，所述靶标序列如SEQIDNO.3所示；(2)将靶标序列去除末端AGG获得sgRNA编码序列，其DNA序列见SEQIDNO.2所示；将SEQIDNO.2序列反向互补获得sgRNA的反向互补序列，其DNA序列见SEQIDNO.4所示；(3)在sgRNA编码序列的5端引入4个额外的碱基GATT，获得SEQIDNO.5序列；在sgRNA编码序列的反向互补序列的5端引入4个额外的碱基AAAC，获得SEQIDNO.6序列；人工合成SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的序列后并将其制备成Oligo二聚体；(4)将制备好的Oligo二聚体连接至载体Cas9的U6启动子下游，然后转化大肠杆菌DH5α获得Cas9-ILK2KO载体。本专利技术还涉及一对用于鉴定所述sgRNA序列敲除效果的引物对，所述引物对的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1)敲除载体Cas9-ILK2KO转化拟南芥后，即可实现高效、快速、特异对拟南芥ILK2基因进行敲除。2)可直接用此做研究材料来探讨ILK2基因的功能和作用机理。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为sgRNA靶点设计结果示意图，其中箭头处代表Cas9酶切位点。图2为农杆菌介导的拟南芥遗传转化得到的T1代植株抽提DNA后进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果(突变序列)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种敲除拟南芥ILK2基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种敲除拟南芥ILK2基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种用于编码如权利要求1所述sgRNA序列的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列如SEQIDNO.2所示。3.一种用于敲除拟南芥ILK2基因的载体，其特征在于，所述载体为含有能表达特异性靶向ILK2基因第一外显子的核苷酸序列的如SEQIDNO.2所示的sgR...
【专利技术属性】
技术研发人员：左开井，王俊，吕萌荔，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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