一种癌症诊断芯片及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种微小核苷酸hsa‑miR‑092a‑1及针对其的基因芯片。本发明专利技术证实了分子标记物hsa‑miR‑092a‑1可以作为靶向提高SCNN1B表达的靶点,在胃癌中具有显著低表达的现象，为有效控制治疗胃癌提供全新的治疗靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种癌症诊断芯片及其试剂盒
本专利技术涉及胃癌的诊断芯片及其试剂盒，属于医药生物

技术介绍
胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。2012年全球新增胃癌病例数95万，死亡病例达到72.3万例，为世界第三大癌症死因，其中42.6％的胃癌发生在中国。2016年中国国家癌症中心发布的最新研究结果显示，在中国胃癌的发病率和死亡率均高居恶性肿瘤的第二位，目前仍是我国第二大最常见恶性肿瘤。胃癌的高发病率和患病率给全球带来了重大社会负担。尤其是尚处于发展中阶段的中国，目前正面临着极大的癌症压力。由于胃癌早期临床表现不典型，不易发现，患者就诊时往往已经是中晚期，加之缺乏有效的治疗手段，因此胃癌仍然是严重影响国人生命健康的重要疾病。因此积极探索胃癌的发病机制，寻找有效的早期诊断及预测临床预后的分子标志物，将为胃癌的诊断和治疗提供重要思路和理论依据，有利于缓解中国乃至全球的癌症负担。总的来说，胃癌男性多发，发病率约为女性的2倍。然而女性更年期后一旦失去雌激素水平保护，其胃癌发病率快速上升至与男性相同。大多数胃癌是腺癌，源自胃粘膜腺上皮，但其组织形态、发病机制和临床表现的差别确是多种多样的。1965年Lauren根据胃癌的组织细胞学特点，将胃癌分成肠型胃癌和弥漫型胃癌。当肿瘤内两种类型成分相当时就称为混合型。流行病学研究发现50％的胃癌为肠型胃癌，而弥漫型胃癌和混合型胃癌分别占35％和15％。肠型腺癌的特征在于有不规则大小不等的腺样结构形成，常常与邻近豁膜的不规则肠化生相关。根据腺体结构，分化程度可分为高分化、中分化和低分化。肠型胃癌较常发生在老年男性患者，与慢性胃炎相关[6]01992年美国学者Correa提出肠型胃癌常常经历一系列癌前病变改变，包括从慢性活动性非萎缩性胃炎一多灶性萎缩一肠化生一不典型增生/腺瘤，最后进展成胃癌。弥漫型胃癌分化程度较差，由散在于胃壁内、浸润性的癌细胞组成，其特征为未形成腺体结构，但能分泌粘液。弥漫型胃癌起源于胃固有钻膜，较常发生在年轻患者，男女比例接近。现代内镜技术日新月异，我们已经可以通过内镜检查识别早期胃癌而改善胃癌患者的总体生存。但在胃癌筛查中，传统方法如粪便隐血检验不够灵敏，导致大量假阴性结果。因此临床上对于无症状或症状不明显的患者进行早期筛查还是很困难。基于DNA分子标记在肿瘤发生中发挥了关键作用，同时分子技术的DNA标记物将对检测肿瘤样品更加敏感，此外，它还可以作为无创检测方法应用于血液检测。前期的研究结果发现，SCNN1B基因在81.3％的胃癌细胞株(13/16)和胃癌组织(P<0.001)中表达沉默，而在人类正常胃组织中高表达。DNA启动子区高甲基化水平与SCNN1B的转录沉默相关。胃癌组织芯片检测结果显示SCNN1B高表达是预测胃癌患者更长疾病特异生存时间的预后因子(P＝0.004)。在胃癌细胞中过表达SCNN1B能抑制细胞生长，诱导凋亡和Go/G1期细胞周期阻滞，抑制细胞迁移与侵袭，体内实验抑制裸鼠皮下移植瘤生长。蛋白SCNN1B与蛋白GRP78直接相互作用，促进泛素化途径介导的蛋白GRP78的降解。随后GRP78蛋白水平的下降引发折叠蛋白应答(unfoldedproteinresponse,UPR)，顺序激活PERK,ATF4,CHOP和XBPIs，导致caspase诱导的细胞凋亡以及对细胞迁移和侵袭的抑制。过表达SCNN1B使胃癌细胞对未折叠蛋白应答(UPR)诱导剂衣霉素((Tunicamycin)细胞毒性的敏感性增强，说明SCNN1B能通过未折叠蛋白应答(UPR)介导肿瘤抑制。补救实验中过表达GRP78抵消SCNN1B对细胞生长和转移的抑制，而敲低GRP78则加强了SCNN1B对细胞生长的抑制。SCNN1B能通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞、抑制细胞迁移和侵袭以及促进细胞粘附，在胃癌行使抑癌基因的功能。我们还发现SCNN1B能通过与GRP78的直接相互作用、导致后者的降解及随后未折叠蛋白应答(UPR)的激活。从而在胃癌中发挥肿瘤抑制作用。SCNN1B的表达状态水平可以用来判断原发性胃癌的生存预后。因此我们还提出SCNN1B可作为胃癌患者判断生存预后的新型肿瘤标志物。基于上述的研究发现，提供一种快速的胃癌检测的标志物以及相应的芯片显得尤为重要。
技术实现思路
根据第一方面，本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供微小核苷酸hsa-miR-092a-1在制备诊断胃癌的芯片中的应用。本专利技术的第二个目的是，提供微小核苷酸hsa-miR-092a-1在制备胃癌预后的疾病进展的芯片中的应用。本专利技术的第三个目的是，提供微小核苷酸hsa-miR-092a-1作为靶向提高SCNN1B表达的靶点在制备治疗胃癌的药物中的应用。本专利技术提供了一种分离的寡核苷酸。根据本专利技术的实施例，所述寡核苷酸具有如SEQIDNO:1所示的序列。根据本专利技术的实施例，专利技术人确定了生物样本存在胃癌的miRNA生物标志物，该miRNA生物标志物具有如SEQIDNO:1所示的序列，并且确定了该miRNA生物标志物与胃癌的诊断/预后以及治疗过程密切相关。其中，上述寡核苷酸的序列如SEQIDNO:1所示：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU。在本专利技术的最后一个方面，本专利技术提供了一种用于确定生物样本存在胃癌的芯片,以及相应的试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包含探针，所述探针特异性识别具有如SEQIDNO:1所示序列的所述的寡核苷酸。利用根据本专利技术的实施例的试剂盒，能够有效地确定生物样品是否存在胃癌。本专利技术可以直接将生物样本中提取分离出完整无降解的RNA，经过荧光标记，利用生物芯片杂交技术进行芯片扫描和分析，从而确定生物体是否存在胃癌。本专利技术优点在于：本专利技术收集胃癌患者和正常人的血浆对全基因组miR表达谱进行研究。研究结果揭示了一系列miRs与胃癌相关，其中发现分子标记物hsa-miR-092a-1作为靶向提高SCNN1B表达的靶点,在胃癌中具有显著低表达的现象；为有效控制治疗胃癌提供全新的治疗靶点。附图说明图1逆转录PCR检测SCNN1B在胃癌细胞株及正常胃组织中的表达:在检测的16株胃癌细胞中，SCNN1B在其中的13株胃癌细胞表达沉默。甲基化特异性PCR检测发现SCNNlB的表达水平下调与其启动子区高甲基化相关。图2胃癌和正常细胞中SCNN1B和hsa-miR-092a-1RNA表达量变化图具体实施方式实施例1胃癌中差异miR分析1、样本的确定本实验选择来自香港威尔斯亲王医院的大样本胃癌临床队列研究((1998年-2002年，平均随访时间为40.8月，最长至157.9月)，并保证每例病例都有5年以上的随访资料以及完整的临床信息。该队列研究纳入245例病例，均为未行新辅助治疗而直接手术切除并同时病理证实为原发性胃癌的患者。所有胃癌病例信息及组织样本收集前，均经过香港中文大学临床研究伦理委员会审议批准，并获得患者及其家属的知情同意。胃癌手术过程中收集胃癌组织及其配对的远端非肿瘤胃组织。标本收集后分为三份，一份进行临床病理验证，一份置入10％福尔马林固定24h(后续以石蜡包埋，制备组织芯片)，一份迅速保存在液氮中备用(以待稍后提取组织RNA和蛋白)。同时收集患者流行病学资料、影像学及其他临床资本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微小核苷酸hsa‑miR‑092a‑1，其序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种微小核苷酸hsa-miR-092a-1，其序列如SEQIDNO：1所示。2.hsa-miR-092a-1在制备用于检测胃癌的芯片中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其中芯片能够特异性的结合SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：申永智，钱云，
申请(专利权)人：申永智，
类型：发明
国别省市：河南,41