一种用于肝癌诊断与治疗的反义长链非编码RNA的分析和制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于肝癌诊断与治疗的反义长链非编码RNA的分析和制备方法，所述反义长链非编码RNA，命名为MEF2D‑AS，其cDNA序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

Analysis and preparation method of antisense long chain non coding RNA for diagnosis and treatment of liver cancer

The invention relates to a method for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma by antisense long chain analysis and preparation method of RNA encoding, the encoding of long chain non antisense RNA, named MEF2D AS, the cDNA sequence with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 shown.

【技术实现步骤摘要】
一种用于肝癌诊断与治疗的反义长链非编码RNA的分析和制备方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于肝癌诊断与治疗的反义长链非编码RNA的分析和制备方法。
技术介绍
天然反义RNA(naturalantisensetranscripts,NATs)是在多个物种中表达的RNA分子，可与正义RNA进行互补配对形成天然双链RNA，通过不同的机制调控正义基因的表达。天然反义RNA在细胞增殖、分化等过程中起重要调控作用，与肿瘤、心血管等疾病密切相关。目前为止，人们对反义RNA及其功能的研究还只是一隅之见，但已为科研者对于基因表达和肿瘤的发生机制开拓了新的视野。肌细胞增强因子2(myocyteenhancerfactor2,MEF2)是一种转录因子，调节骨骼肌细胞、免疫细胞中多个基因的转录。MEF2D为MEF2家族中的一员，它在细胞的存活与分化方面有非常重要的作用。有研究表明，MEF2D不仅能促进VEGF信号通路的活化，对细胞的增殖能力也有一定的提高，对肝细胞癌(HCC)的发生发展有着重要作用。由于人们对肝癌与反义RNA关系的高度关注，越来越多与肝癌相关的反义RNA被发现并深入研究；与此同时，它们在肝癌中的作用机制将逐渐被丰富，有望帮助人们对肝癌的发生、发展做进一步的了解，并期待在肝癌的预测、诊断、预后和治疗中有新的突破。本专利技术通过对HepG2肝癌细胞双链RNA文库进行研究，得到一种MEF2D反义RNA，其对MEF2D基因的表达有明显的抑制作用，命名为MEF2D-AS。
技术实现思路
本专利技术提供一种反义长链非编码RNA(命名为MEF2D-AS)，其特征在于MEF2D-AS的cDNA序列具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。本专利技术提供一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括MEF2D基因的正、反义特异性引物：5′-TTACCAGTTGACCAGTGCAG-3′和5′-TTGCCAGGCAGTGACATT-3′。本专利技术的另一实施方案提供上述MEF2D基因的正、反义特异性引物在制备检测肝癌细胞HepG2中MEF2D-AS表达量试剂盒中的应用。本专利技术提供2条特异性引物：3’GSP：5′-TGAGAGATACAGGGACCAGGTGGGA-3′5’GSP：5′-TCCTCCTTACCAGCCTTTAGTTCACCT-3′。本专利技术的另一技术方案提供上述特异性引物3’GSP和5’GSP在测定MEF2D-AS全长序列中的应用。本专利技术提供一种测定MEF2D-AS全长序列的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)总RNA的提取；(2)以3'CDSprimer为特异性逆转录引物对总RNA进行特异性逆转录，合成第一链cDNA后，以特异性引物和试剂盒引物进行PCR扩增以获得MEF2D-AScDNA3'端，即3'-RACE(3'-端扩增产物)；(3)以5'CDSprimer为特异性逆转录引物对总RNA进行特异性逆转录，以特异性引物和试剂盒引物进行PCR扩增以获得MEF2D-AScDNA5'端，即5'-RACE(5'-端扩增产物)；(4)将步骤(3)、(4)所有获得的3'-RACE和5'-RACE片段均克隆到pGEM-TEasy载体中，进行序列测定，经测序确定3'-RACE片段长度为800bp，5'-RACE片段长度为662bp；(5)用DNAMANV6软件拼接得到长度为1265bp的RNA，通过BLAST发现MEF2D-AS基因转录起始于MEF2D的第8个内含子第100位碱基的反义链配对碱基，完全与MEF2D第8个外显子重叠(241bp)。其中步骤(1)中总RNA的提取可按照TRIzolTM试剂说明书中记载的方法进行提取，或按照其他本领域常规的总RNA的提取方法进行提取；步骤(2)所述的特异性引物为3’GSP(5′-TGAGAGATACAGGGACCAGGTGGGA-3′)，试剂盒引物为UPMLongprimer(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)和UPMShortprimer(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)；步骤(3)所述的特异性引物为5’GSP(5′-TCCTCCTTACCAGCCTTTAGTTCACCT-3′)和SMARTerIIAOligonucleotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG-3′)，试剂盒引物为UPMLongprimer(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)和UPMShortprimer(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)。上述步骤(5)后，可通过设计特异性逆转录引物，合成cDNA后，进行PCR扩增，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定和DNA序列测定，测序结果如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。所述特异性逆转录引物序列如下：GSP：5′-GGTGGTTTTTAAAAATAGTGTTGAAC-3′反向引物：5′-CTCTTGGTCGGATGCGGT-3′正向引物：5′-CAGAGGGGGTGAGTGACAGAA-3′。本专利技术提供一种检测肝癌细胞HepG2中MEF2D-AS表达量的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计MEF2D基因的正、反义特异性引物：5′-TTACCAGTTGACCAGTGCAG-3′和5′-TTGCCAGGCAGTGACATT-3′；(2)总RNA的提取；(3)以步骤(1)设计的特异性引物对步骤(2)得到的RNA进行特异性逆转录，而后进行PCR，PCR条件为94℃5min变性；94℃30s，60℃30s，72℃40s(40个循环)；72℃5min延伸；(4)步骤(3)的PCR结果采用GraphPadPrism5软件进行分析得到肝癌细胞HepG2中MEF2D-AS表达量。其中步骤(2)中总RNA的提取可按照TRIzolTM试剂说明书中记载的方法进行提取，或按照其他本领域常规的总RNA的提取方法进行提取。本专利技术的另一实施方案提供一种基因治疗剂，其特征在于该基因治疗剂通过增加上述反义长链非编码RNA(MEF2D-AS)的表达来发挥作用。进一步该基因治疗剂通过增加反义RNA(MEF2D-AS)的表达，降低相应正义RNA(MEF2D-S)的表达来发挥作用。本专利技术的另一实施方案提供所述反义长链非编码RNA(MEF2D-AS)在制备以MEF2D-AS为靶点的药物中的用途。本专利技术的另一实施方案提供所述反义长链非编码RNA(MEF2D-AS)在制备药物中的用途，其特征在于所述药物的作用靶点为MEF2D-AS，具体是通过提高MEF2D-AS的表达，下调MEF2D的表达，来发挥作用的。本专利技术提供一种DNA甲基化酶抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于所述DNA甲基化酶抑制剂是通过提高反义RNA(MEF2D-AS)的表达，从而下调癌相关基因MEF2D，进而抑制肝癌细胞增殖，来发挥作用的。本专利技术中涉及引物的设计合成，均是根据GeneBank或其他分析结果中基因序列的特点，借助PrimerPrimer5.0软件进行设计，送公司进行合成。附图说明图1PCR产物(MEF2D-AS)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反义长链非编码RNA(命名为MEF2D‑AS)，其特征在于MEF2D‑AS的cDNA序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种反义长链非编码RNA(命名为MEF2D-AS)，其特征在于MEF2D-AS的cDNA序列具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。2.两条特异性引物3’GSP和5’GSP，其特征在于序列如下：3’GSP：5′-TGAGAGATACAGGGACCAGGTGGGA-3′5’GSP：5′-TCCTCCTTACCAGCCTTTAGTTCACCT-3′。3.权利要求2所述的特异性引物3’GSP和5’GSP在测定MEF2D-AS全长序列中的应用。4.一种测定MEF2D-AS全长序列的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)总RNA的提取；(2)以3'CDSprimer为特异性逆转录引物对总RNA进行特异性逆转录，合成第一链cDNA后，以特异性引物和试剂盒引物进行PCR扩增以获得MEF2D-AScDNA3'端，即3'-RACE(3'-端扩增产物)；(3)以5'CDSprimer为特异性逆转录引物对总RNA进行特异性逆转录，以特异性引物和试剂盒引物进行PCR扩增以获得MEF2D-AScDNA5'端，即5'-RACE(5'-端扩增产物)；(4)将步骤(3)、(4)所有获得的3'-RACE和5'-RACE片段均克隆到pGEM-TEasy载体中，进行序列测定，经测序确定3'-RACE片段长度为800bp，5'-RACE片段长度为662bp；(5)用DNAMANV6软件拼接得到长度为1265bp的RNA，通过BLAST发现MEF2D-AS基因转录起始于MEF2D的第8个内含子第100位碱基的反义链配对碱基...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔恒宓，李华玲，吕贝，袁君婷，李新秀，耿拓宇，胡江，胡莉娟，吴奕帆，盛雅婷，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32