本发明专利技术公开了一种同时进行脊髓性肌萎缩症和原发性免疫缺陷病筛查的引物探针组合及其应用、检测试剂盒及检测方法，该检测试剂盒内包括筛查检测脊髓性肌萎缩症基因检测的引物和探针，筛查检测原发性免疫缺陷病(重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症)基因(TREC，KREC)检测的引物和探针。本发明专利技术可建立灵敏度高、准确性高、成本低、周期短的多重数字PCR检测体系，在1个反应内实现同时对遗传病脊髓性肌萎缩症(SMA)致病基因SMN1拷贝数、对重症联合免疫缺陷病相关标记物TREC拷贝数以及对无丙种球蛋白血症相关标记物KREC拷贝数的定量检测，从而一次性筛查上述三种疾病。
A primer probe combination for disease screening and its application, kit and detection method
【技术实现步骤摘要】
一种疾病筛查引物探针组合及其应用、试剂盒与检测方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及核酸检测领域，更具体地，是涉及一种同时筛查遗传病脊髓性肌萎缩症(SMA)和原发性免疫缺陷病的多重数字PCR检测方法、引物探针组合及检测试剂、试剂盒应用。
技术介绍
脊髓性肌肉萎缩症(SMA)是一种遗传性神经肌肉病，其特征是脊髓前角的运动神经元退化，导致严重的、渐进性的对称性肌肉无力和萎缩。SMA患者可能丧失行动能力，并且难以完成呼吸和吞咽等基本生活功能。如果不进行治疗，大多数患有较严重疾病类型(SMAI型)的婴儿在没有呼吸干预的情况下，无法活到两岁。据统计，新生儿SMA发病率为1/6000～1/10000，人群携带率为1/35～1/50，居致死性常染色体遗传病第二位。目前，SMA已经出现了针对性的特效治疗，美国FDA已经批准了Spinraza和Zolgensma两种特效药物的上市，在我国NMPA也已批准了Spinraza上市，并于2019年10月份启动了首批患者的治疗。临床研究试验表明，在疾病症状前阶段给予SMA患儿Spinraza的治疗，能显著的提高患儿存活率，降低呼吸干预率，减少运动发育落后。因此，对SMA患者进行早期诊断及早期治疗至关重要。原发性免疫缺陷病(primaryimmunodeficiencydisease，PID)是一类由于基因缺陷造成的免疫系统损伤性疾病，多数为单基因缺陷，如不及时诊治，大部分患儿在年幼时即发生反复严重感染，甚至可导致死亡。其中，重症联合免疫缺陷病(severecombinedimmunodeficiency，SCID)是最严重的联合免疫缺陷病，发病率约为1：58000。大部分SCID患者出生时无明显异常，但随着母传抗体的消耗，患儿自己无法建立自身免疫系统，在婴儿早期(3～6月龄)开始发生严重的反复感染。此外，婴儿接种减毒活疫苗(如卡介苗、水痘疫苗等)时，可能患上严重的传染性疾病。反复腹泻、严重感染会造成SCID患儿体型消瘦、生长发育缓慢，不经治疗，SCID患儿在2岁前的死亡接近100％。目前SCID患儿可通过同种异体造血干细胞移植、基因治疗或酶替代治疗进行免疫重建。异体造血干细胞移植是目前最常用并有效的治疗方法。一项研究通过随访240例移植后的SCID患者，认为＜3.5月龄的SCID患者移植的存活率显著高于＞3.5月龄或继发感染的患儿，且移植后的存活率主要与患儿有无感染相关，与移植物的来源无明显关联。因此，对SCID患者进行早期诊断及早期治疗，可显著改善患儿的预后。X连锁无丙种球蛋白血症(X-linkedagammaglobulinemia，XLA)，又称Bruton无丙种球蛋白血症，是由于Bruton酪氨酸激酶BTK基因突变，使B细胞系列发育障碍，从而导致外周血B淋巴细胞缺乏、血清免疫球蛋白水平降低或缺失、感染易感性增加的一种原发性体液免疫缺陷病，是原发性B细胞缺陷的典型代表。XLA绝大多数为男性患儿，多于出生后4-12个月开始出现反复感染症状。此外，个别XLA患儿还可以发生肿瘤、自身免疫和炎症性疾病。未接受正规治疗的XLA患儿预后差，大约50％以上会伴发肺部慢性感染，且常有阻塞性肺部疾病或肺源性心脏病；伴发慢性播散性肠道病毒感染者也不少见；约2％的患儿伴发淋巴网状组织恶性肿瘤而死亡。静脉免疫球蛋白(IVIG)是XLA的一线治疗方法，可控制大多数XLA患儿的感染症状，使全身状况迅速改善。但如果IVIG治疗开始较晚，感染所致的器质性损害将是不可逆的。而早期诊断和常规使用丙种球蛋白替代治疗可使本病的预后大大改观，绝大部分患儿能够无症状生存。以上3种疾病都属于我国的第一批罕见病目录中的重大出生缺陷疾病，且都具有出生时无明显症状、有可治疗干预手段、诊断治疗时机对预后影响大的特点。因此，针对以上疾病开发筛查试剂，可帮助提前检出潜在患儿，及早干预治疗，避免不可逆损伤发生。其中，脊髓性肌萎缩症的主要致病基因是位于染色体5q11.2-q13.3的SMN1基因，约80％～95％的SMA患者存在SMN1基因的纯合缺失，少数存在复合杂合突变，最终导致SMN蛋白表达量下降。在人类基因组上，SMN基因存在2个高度同源的拷贝，分别为端粒侧SMN1和着丝粒侧SMN2；二者序列仅存在5个碱基差异，其中有2个碱基位于第7和8号外显子，另外三个位于内含子6、7内。尽管序列相似，但SMN2蛋白仅具有约5-10％的SMN1蛋白活性，仅对SMN1缺失存在少量的补偿作用。目前SMA疾病进行分子检测的方法主要包括多重连接依赖性探针扩增(MLPA)方法、荧光定量PCR方法、PCR-RFLP方法等。MLPA方法原理是针对c.840C>T位点设计不同的探针序列，SMN1基因扩增子可以扩增出不同的片段长度，以峰的高度来反映拷贝数变异。荧光定量PCR方法可以定量检测SMN1的拷贝数变化。PCR-RFLP方法是首先对目标区域进行扩增，然后通过限制性内切酶或一代测序的方法来区分。T细胞受体切除环(T-cellReceptorExcisionCircles，TRECs)是在胸腺发育成熟过程中，编码T细胞受体的基因进行重组，重组过程中生成了小片段的游离环状DNA。T细胞分裂过程中TRECs不复制，因此可作为判断胸腺输出初始T淋巴细胞功能的可靠指标。B细胞早期成熟发育过程中亦可产生类似于TREC的DNA片段，即kapa重排剪切环(k-deletingrecombinationexcisioncircles，KREC)，同TREC性质相仿，KREC可作为近期骨髓输出B细胞的标志。T细胞受体切除环和kapa重排剪切环都被应用到了新生儿原发性免疫缺陷病(PID)的筛查中。TREC拷贝数可作为重症联合免疫缺陷病(SCID)的筛查标志物，在新生儿中若TRECs减少或缺失，则高度怀疑SCID，进一步行流式细胞及基因诊断确诊。KREC拷贝数可作为X－连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的筛查标志物，在新生儿中若KRECs减少或缺失，则高度怀疑XLA,进一步进行免疫检查及基因诊断确诊。目前，原发性免疫缺陷病进行新生儿筛查的主要方法包括荧光定量PCR方法和时间分辨荧光能量共振转移等，检测TREC和KREC拷贝数的方法有荧光定量PCR方法等。现有检测方法存在以下缺陷：1、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)方法来检测SMN1基因拷贝数，实验操作复杂，周期相对较长，一般实验操作需要3天左右时间，试剂昂贵，不容易临床推广。2、荧光定量PCR方法来检测SMN1基因拷贝数，需要依赖于正常对照样本的检测结果，并且计算比较复杂，而且无法区分微小变化差异的拷贝数变化。3、PCR-RFLP方法来检测SMN1基因拷贝数，只能检测纯合缺失的情况，不能检测含有1个拷贝的携带者。4、荧光定量PCR方法来检测TREC和KREC拷贝数，实时荧光定量扩增法主要通过标准质控品的曲线对目标序列拷贝数进行相对定量，其检测结果的准确性和稳定性受标准品影响较大，最终导致较高的假阳性和假阴性。此外，目前也有采用数字PCR方法来单独检测SMN1或者TREC、KREC的拷贝本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物探针组合，其特征在于，包括如下引物探针组的至少一种：/n(1)用于检测SMN1基因的引物探针组，含有：如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：AAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTC(SEQ ID NO.1)；如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物：CTTACTCCTTAATTTAAGGAATGTG(SEQ ID NO.2)；如SEQ ID NO.3所示序列的探针：TACAGGGTTTCAGACAAAA(SEQ ID NO.3)；/n(2)用于检测TREC基因的引物探针组，含有：如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物：ATGCTGACACCTCTGGTTTT(SEQ ID NO.4)；如SEQ ID NO.5所示序列的下游引物：TGAGAACGGTGAATGAAGAG(SEQ ID NO.5)；如SEQ ID NO.6所示序列的探针：CGGTGATGCATAGGCACCTGCAC(SEQ ID NO.6)；/n(3)用于检测KREC基因的引物探针组，含有：如SEQ ID NO.7所示序列的上游引物：CTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTG(SEQ ID NO.7)；如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物：GAGCCAGCTCTTACCCTAGAGTTT(SEQ ID NO.8)；如SEQ ID NO.9所示序列的探针：CACGGGCAGCAGGTTGGC(SEQ ID NO.9)；/n(4)用于检测内参TRAC基因的引物探针组，含有：如SEQ ID NO.10所示序列的上游引物：GTCCTAACCCTGATCCTC(SEQ ID NO.10)；如SEQ ID NO.11所示序列的下游引物：CTGGATTTAGAGTCTCTCAG(SEQ ID NO.11)；如SEQ ID NO.12所示序列的探针：AACCCTGACCCTGCCGTGTA(SEQ ID NO.12)；/n上述各探针还包括荧光修饰剂和荧光淬灭剂。/n...
【技术特征摘要】
1.一种引物探针组合，其特征在于，包括如下引物探针组的至少一种：
(1)用于检测SMN1基因的引物探针组，含有：如SEQIDNO.1所示序列的上游引物：AAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTC(SEQIDNO.1)；如SEQIDNO.2所示序列的下游引物：CTTACTCCTTAATTTAAGGAATGTG(SEQIDNO.2)；如SEQIDNO.3所示序列的探针：TACAGGGTTTCAGACAAAA(SEQIDNO.3)；
(2)用于检测TREC基因的引物探针组，含有：如SEQIDNO.4所示序列的上游引物：ATGCTGACACCTCTGGTTTT(SEQIDNO.4)；如SEQIDNO.5所示序列的下游引物：TGAGAACGGTGAATGAAGAG(SEQIDNO.5)；如SEQIDNO.6所示序列的探针：CGGTGATGCATAGGCACCTGCAC(SEQIDNO.6)；
(3)用于检测KREC基因的引物探针组，含有：如SEQIDNO.7所示序列的上游引物：CTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTG(SEQIDNO.7)；如SEQIDNO.8所示序列的下游引物：GAGCCAGCTCTTACCCTAGAGTTT(SEQIDNO.8)；如SEQIDNO.9所示序列的探针：CACGGGCAGCAGGTTGGC(SEQIDNO.9)；
(4)用于检测内参TRAC基因的引物探针组，含有：如SEQIDNO.10所示序列的上游引物：GTCCTAACCCTGATCCTC(SEQIDNO.10)；如SEQIDNO.11所示序列的下游引物：CTGGATTTAGAGTCTCTCAG(SEQIDNO.11)；如SEQIDNO.12所示序列的探针：AACCCTGACCCTGCCGTGTA(SEQIDNO.12)；
上述各探针还包括荧光修饰剂和荧光淬灭剂。
2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，用于检测SMN1基因的探针、用于检测内参TRAC基因的探针采用FAM进行荧光修饰，用于检测TREC基因的探针、用于检测KREC基因的探针采用HEX或VIC进行荧光修饰；或者，
用于检测SMN1基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈艳，陈珺，
申请(专利权)人：上海捷易生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。