电化学代谢活性检测装置制造方法及图纸

用于检测样本中目标细胞的代谢活性的方法和装置。目标细胞浓缩在具有微过滤器的纳升孔内。引入表现出响应目标细胞代谢活性的电化学状态变化的报告化合物。基于测定的孔内内含物的电化学状态的变化，检测目标细胞的代谢活性或活力。

Electrochemical metabolism activity detecting device

Method and apparatus for detecting metabolic activity of target cells in a sample. The target cells are concentrated in the micro aperture of the micro filter. A reporter compound exhibiting an electrochemical state change responsive to target cell metabolic activity is introduced. Based on the determination of the electrochemical state of the inclusion in the pore, the metabolic activity or activity of the target cell was detected.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】电化学代谢活性检测装置相关申请的交叉引用本申请要求2014年10月28提交的美国临时专利申请第62/069,601号的优先权，过引用将该申请全文纳入本文。领域本专利技术涉及用于检测样本中目标细胞的代谢活性的方法和系统。在一些实施方式中，本专利技术涉及抗生素敏感性的电化学检测。
技术介绍
抗生素的过度使用和对病原体不敏感的一线抗生素处方导致抗生素耐药率升高，这是日益增长的对全球公共健康的威胁。1尿路感染是其中最普遍的细菌感染。2用于尿路感染的金标抗生素敏感性实验依赖于培养，并且通常需要1～3天，以使得细菌繁殖至可检测水准。3在细菌预培养之后，通常需要额外的18小时以进行标准敏感实验。减少确定尿路感染的敏感曲线(susceptibilityprofile)所需时间能够改善临床结果，特别是在大多数导致尿脓病症的重度感染的情况下。4快速实验还可以有利于减少使用不必要的抗生素，5并且提高集中诊断实验室的效率。其它感染的治疗也可以类似地从改善敏感实验中获益。已经发现与培养相比，将取决于抗生素耐药基因的酶扩增的用于抗生素耐药性的试验能缩短周转时间。6、7、8、9不幸的是，这些化验经常需要预孵育(pre-incubation)步骤，以使得细菌繁殖，并且进一步还需要数小时以放大所针对的基因。基于基因的化验通常还受到知道哪些基因赋予耐药性的先验要求限制。许多不断演化的基因可能涉及对于给定抗生素的耐药性，并且可能不能实现对于所有可能的突变的试验。10监测对抗生素进行响应的细菌活力的化验可以克服基因试验的至少部分限制。这些实验直接报告了临床上最重要的问题：给定抗生素是否降低了细菌的残存率(bacterialsurvival)。新的用于抗生素耐药性的化验包括：使用AFM悬臂检测细菌运动11、细菌生长的电化学检测12、13、14、15、16、细菌生长的光学检测17、18、以及细菌代谢的氧化还原报告物的光学检测19、20、21、22。在检测代谢活性病原体的化验中，细菌通常用抗生素和代谢的氧化还原报告物例如刃天青或亚甲基蓝进行孵育。代谢活跃细菌产生了还原环境并且直接或间接对化合物进行还原，并且氧化还原状态读取为颜色或荧光的变化。耐药性细菌持续繁殖并且代谢化合物，而敏感性细菌则不会。使用该类型方法的成功检测通常取决于足够量的还原形式的报告物累积超过检测阈值，可能需要至少12小时延迟(在毫升规模的培养中)。19已经提出了旨在将细菌限制在微升和纳升体积的策略，目的是通过增加细菌的局部浓度来减少检测时间。20、21、23、24、25在这些光学技术中最敏感的是，样本被分成数百万的纳升液滴，并且用大功率荧光显微镜从每个液滴顺序地读出信号。20、21、25尽管通过该方法提供了局部有效浓度的增加，通常还需要几个小时进行分析。此外，这些装置中的许多只检测病原体的存在与否，而不是其抗生素敏感曲线。25、26、27
技术实现思路
在一些示例中，本专利技术描述了适用于检测样本中目标细胞的代谢活性的装置。该装置包括：纳升孔(nanoliterwell)，其包括：用于接收样本的入口；用于抑制目标细胞通过孔的出口离开孔的微过滤器；以及用于感测孔内内含物的电化学状态的孔内电极。在一些示例中，所述装置可以进一步包括：多个孔。在一些示例中，本专利技术描述了适用于检测样本中目标细胞的代谢活性的方法。所述方法包括：将目标细胞集中在纳升孔内；向孔内引入响应目标细胞代谢活性而呈现电化学状态变化的报告化合物；确定一段时间内孔内内容物电化学状态的变化；并且基于所述孔内的内容物的电化学状态的确定变化来检测目标细胞的代谢活性或活力。附图的简要说明以示例的方式参考显示本专利技术示例性实施方式的附图，附图中：图1A显示了刃天青被还原为试卤灵的过程；图1B和1C是所公开的装置的示例的示意图；图1D显示所公开装置的示例性操作；图1E显示了显示用于检测抗生素敏感性的电化学表型的原理的差示脉冲伏安图；图2A显示从大肠杆菌(E.coli)的连续稀释培养5小时后得到的代表性差示脉冲伏安图；图2B显示在用刃天青培养大肠杆菌(E.coli)5小时后得到的平均信号下降；图2C显示当大肠杆菌(E.coli)的代谢活性通过加热死亡停止时得到的平均信号下降；图3A是使用所公开的装置的示例的孔内细菌捕获的另一示意图；图3B是包括微珠的孔的微过滤器的示例性光学图像；图3C是显示通过微珠过滤器捕获在孔内的大肠杆菌(E.coli)的荧光图像；图3D显示作为所引入的细菌浓度函数的所公开装置的示例的捕获效率；图4是说明使用所公开的装置的示例的细菌活力的电化学测定图；图5A-5E是说明大肠杆菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)对氨苄青霉素和环丙沙星的敏感性的图；图6A和6B显示了不同缓冲剂中的循环伏安图和差示脉冲伏安图；图7A和7B是显示由于通过细菌还原在刃天青中的电化学变化图；图8A和8B显示溶解氧对刃天青的电化学影响的图表。图9显示了代谢活性大肠杆的菌荧光检测的示例性结果；图10A和10B显示所公开装置示例的光学图像；图11示意性地说明了所公开装置示例的示例性制造方法；图12A和12C是在所公开装置的示例中形成微过滤器的微珠的示例性光学图像；图12B是表示球体的六方密堆积的示意图；图12D显示了比较使用微珠和不使用微珠的情况下大肠杆菌(E.coli)的捕获率的图；图12E是说明大肠杆菌(E.coli)的捕获效率是流速的函数的图；图13是在所公开装置示例中显示微珠稳定性的一系列光学图像；图14显示在应用回流之前和之后在所公开装置示例中捕获的大肠杆菌(E.coli)的示例性荧光图像；图15A显示在所公开装置示例中电沉积电极之前和之后的刃天青的电化学测定结果；图15B说明了在所公开装置示例中表面结垢对电极的影响；图16显示了表明抗生素阻碍细菌的代谢活性所需时间的示例性结果；图17显示使用所公开装置和常规化验进行的敏感性化验之间的相关性；图18说明预过滤器尺寸对回收掺入未稀释尿中的细菌的影响；图19A-19D是显示在引入掺入尿液中的大肠杆菌(E.coli)以及刃天青和抗生素后使用示例性装置获得的代表性电化学扫描图；图20是所公开装置的另一示例的示意图；以及图21是可以在所公开装置示例中使用的电极层。类似的附图编号可以在不同的附图中使用以表示类似的部件。示例性实施方式的描述除了近来在细菌的超敏电化学检测方面取得了一些进展28、29、30，还报道了一些用于抗生素耐药性的直接电化学检测的装置。电化学读数通常仅需要简单的电子器件，这可以使得对受限纳升液滴的抗生素敏感性进行直接电子检测，而不需要用于读取的庞大光学仪器。本专利技术描述了用于生物试剂(例如细菌)代谢活性电子检测的方法和装置。本专利技术的例子可以用于帮助鉴定细菌的抗生素敏感曲线。本专利技术描述了可以使用电化学读取以检测代谢活性细菌的示例性化验的研究。在本文所述示例中，监控报告化合物(例如刃天青)的电化学还原以确立存活细菌的存在，并且进一步可以在抗生素存在下进行分析以确定耐药性曲线。在本文中所讨论的各种例子中，刃天青可以用作报告化合物。通常，报告化合物可以是存在对目标细胞(例如细菌)的代谢活性进行响应的电化学变化(例如，氧化态变化)的任何化合物。对于给定浓度或量的报告化合物，报告化合本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测样本中目标细胞的代谢活性的方法，所述方法包括以下步骤：在纳升孔内浓缩靶细胞；将报告化合物引入孔内，所述报告化合物呈现对目标细胞代谢活性进行响应的电化学状态变化；确定一段时间内的孔内内容物的电化学状态变化；基于经确定的孔内内容物的电化学状态变化，检测目标细胞的代谢活性或活力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.28 US 62/069,6011.用于检测样本中目标细胞的代谢活性的方法，所述方法包括以下步骤：在纳升孔内浓缩靶细胞；将报告化合物引入孔内，所述报告化合物呈现对目标细胞代谢活性进行响应的电化学状态变化；确定一段时间内的孔内内容物的电化学状态变化；基于经确定的孔内内容物的电化学状态变化，检测目标细胞的代谢活性或活力。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标细胞包括以下至少一种：细菌、哺乳动物细胞、或真菌。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样本是生物流体。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物流体是以下中一种：尿液、血液、血浆、或唾液。5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样本为以下中一种：水或缓冲液。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述报告化合物是以下一种：刃天青、亚甲基蓝，甲或四唑鎓盐。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：将样本孵育所述一段时间的至少部分。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：基于检测的代谢活性或活力估算样本中目标细胞的量。9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：在确定孔内内容物电化学状态变化之前，将抗生素引入...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·O·凯利，E·H·萨金特，J·D·贝森特，
申请(专利权)人：多伦多大学管理委员会，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA