电化学活性高分子辅酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种电化学活性高分子辅酶及其制备方法，电化学活性高分子辅酶是在高分子的骨架上通过化学反应引入电子媒介体和辅酶。所述电子媒介体为邻苯二酚残基或间苯二酚残基。所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。本发明专利技术电化学活性高分子辅酶参与脱氢酶的催化反应，电化学活性基团作为电子媒介体在较低的电位下催化生成的还原型辅酶在电极表面的氧化再生。本发明专利技术制备的电化学活性高分子辅酶适应多种脱氢酶，易于在电极表面固定化，且固定化后辅酶和电子媒介体分子不易流失，适用于无试剂化传感器的构筑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于生物电化学领域。
技术介绍
以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶NAD+)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶NADP+) 为电子受体的脱氢酶是所有氧化还原酶中最大的一类。据不完全统计有超过四百种的脱氢酶 以NAD+或NADP+作为辅酶，如常见的醇脱氢酶，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，谷氨酸脱氢 酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。其基本催化反应方程式如下(式中E代表脱氢酶)。<formula>formula see original document page 3</formula>在脱氢酶催化反应中，辅酶NAD+或NADP+作为电子和氢的受体，反应后生成还原型辅 酶NADH或NADPH。对反应中产生的还原型辅酶的测定是构筑脱氢酶电化学生物传感器的 基础。由于基于辅酶的脱氢酶数量众多，因此开发此类传感器具有极其重要的意义。但此类脱氢酶电化学生物传感器的构筑中，常遇到以下技术难点。反应中生成的还原型 辅酶NADH或NADPH在裸电极上的直接电化学氧化过电位高(通常在+l.O V以上)，副反 应严重。 一般的解决办法是采用电子媒介体修饰电极。常用的电子媒介体包括醌类衍生物， 二茂铁及其衍生物以及多种有机染料等。除此之外，小分子量水溶性辅酶的固定化是困扰脱氢酶传感器构筑的另一个难点。 虽然经典的戊二醛法可以将脱氢酶和辅酶交联固定在电极表面，但酶的活性会受到化学反应 的影响；也有将脱氢酶和辅酶直接与碳糊混合得到碳糊修饰电极的报道。但小分子量辅酶易于流失，传感器的稳定性不佳。由于辅酶在电极表面固定化困难，因此很多脱氢酶传感 器在分析中需要在分析体系中加入NAD+或NADP+，这样不仅操作复杂，而且由于辅酶本身价格昂贵，辅酶的一次性使用导致分析成本较高。为了解决辅酶固定化的难点，陆续有新的方法出现，高分子辅酶就是其中之一。通过化学方法将辅酶连接到高分子骨架上可以得到高分子辅酶。高分子辅酶由于本身分子量提 高，因此固定化后辅酶难以从电极表面脱离。同时，高分子化还有利于的辅酶稳定性。高分 子辅酶已经开始用于脱氢酶传感器的制备。但上述文献中，电子媒介体和高分子辅酶需要分 别固定，操作步骤较繁琐
技术实现思路
.本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种电化学活性高分子辅酶。本专利技术的第二个目的是提供一种电化学活性高分子辅酶的制备方法。 本专利技术的技术方案概述如下一种电化学活性高分子辅酶，是在高分子的骨架上通过化学反应引入电子媒介体和辅酶。 所述电子媒介体为邻苯二酚残基或间苯二酚残基。 所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。 一种电化学活性高分子辅酶的制备方法，是由下述歩骤组成(1) 将40 120 mg 3， 4-二羟基苯甲醛或2， 4-二羟基苯甲醛溶解在15~100 mL乙醇或 甲醇中，得到溶液A;(2) 将200 500mg聚乙烯亚胺或聚丙烯胺溶解在20 60mL乙醇或甲醇中，得到溶液B;(3) 在20 35。C，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌1 3小时，冷却至(TC 4r， 加入15-40 mg硼氢化钠，反应1 3小时，反应生成物经真空干燥后，用2 8mL蒸馏水溶解， 过滤，滤液在室温下在蒸馏水中透析12 36小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子；(4) 将3 8g丁二酸酐溶解在30 50mL二甲基亚砜中，加入180-300 mg烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，20 35i:反应12-36小时，加入40 90mL丙酮，有 沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤2~4次，将沉淀加入到2~5 ml质量百分浓度为5~15%的 l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为4 6，反应0.5 2小时， 加入步骤(3)制备的电化学活性高分子200 500mg，在0'C 4'C反应12-24小时，反应产物 在4'C在50~100 mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析12~48小时，再在蒸馏水中透 析12-48小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。所述歩骤(1)优选的是将70-90 mg 3， 4-二羟基苯甲醛或2， 4-二羟基苯甲醛溶解在 45~70 mL乙醇或甲醇中，得到溶液A。所述歩骤(2)优选的是将300-400 mg聚乙烯亚胺或聚丙烯胺溶解在30-50 mL乙醇或 甲醇中，得到溶液B。所述歩骤(3)优选的是在25 3(TC，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌2小时， 冷却至rC 3'C，加入20-28 mg硼氢化钠，反应2小时，反应生成物经真空干燥后，用3 6 raL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温下在蒸馏水中透析24小时，析液经干燥后得到电化学活 性高分子。所述歩骤(4)优选的是将5~6 g 丁二酸酐溶解在35~45 mL 二甲基亚砜中，加入220-260 mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，25 3(TC反应24小时，加入50~80 mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤3次，将沉淀加入封3 4ml质量百分浓度 为10%的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为4.5 5.5，反应 1小时，加入歩骤(3)制备的电化学活性高分子300 400mg，在TC 3'C反应16-20小时， 反应产物在4'C在60 70mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析24~36小时，再在蒸馏 水中透析24 36小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。本专利技术的优点(1)本专利技术在高分子骨架上同时引入电子媒介体和辅酶基团，得到了具有电子媒介体活性和辅酶生物活性的双功能高分子衍生物-电化学活性高分子辅酶。(2) 本专利技术制备的电化学活性高分子辅酶参与脱氢酶的催化反应，电化学活性基团作为电 子媒介体在较低的电位下催化生成的还原型辅酶在电极表面的氧化再生。(3) 本专利技术制备的电化学活性高分子辅酶适应多种脱氢酶，易于在电极表面固定化，且固 定化后辅酶和电子媒介体分子不易流失，适用于无试剂化传感器的构筑。附图说明图1为实施例1中起始反应物聚乙烯亚胺(PEI， l号曲线)，中间产物聚乙烯亚胺-邻苯 二酚(PEI-DHB, 2号曲线)和最终产物聚乙烯亚胺-邻苯二酚-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (PEI-DHB-NAD， 3号曲线)的紫外吸收光谱图。图2为PEI-DHB-NAD和乙醇脱氢酶在加入乙醇前(4号曲线)和加入乙醇后(5号曲 线)的紫外吸收光谱。图3PEI (6号曲线)，PEI-DHB-NAD (7号曲线)和邻苯二酚(8号曲线)的循环伏 安曲线。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1一种电化学活性高分子辅酶的制备方法(1) 将80mg 3， 4-二羟基苯甲醛(3,4-DHB)溶解在25 mL乙醇中得到溶液A;(2) 将300mg聚乙烯亚胺(PEI)溶解在30mL乙醇中，得到溶液B;(3) 在室温下，将3， 4-DHB乙醇溶液缓慢滴加到PEI乙醇溶液中，充分搅拌1小时，冷却至 (TC，加入28mg硼氢化钠，反应2小时，反应生成物经真空干燥后，用3mL蒸馏水溶解， 水溶液经过滤后，滤液在室温下在蒸馏水中透析24小时，透析液经真空干燥后得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电化学活性高分子辅酶，其特征是在高分子的骨架上通过化学反应引入电子媒介体和辅酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海涛，
申请(专利权)人：天津工业大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]