一种用电化学活性开关分子信标检测核酸的方法技术

一种用电化学活性开关分子信标检测核酸的方法，属于化学分析方法的技术领域，包括电化学活性开关分子信标的合成和检测样品中特定序列的核酸分子的两个步骤。所述的分子信标无电化学活性，但与目标分子结合后，因其茎环结构发生改变而具有电化学活性，产生与溶液中的核酸的浓度呈线性关系的氧化峰电流。由此还可计算核酸目标分子的含量。该方法以电化学活性开关分子信标为检测探针，无试剂，不需要固定，选择性好、灵敏、简便、快速直接均相测定核酸等生物分子，检测的线性范围宽，特别适于检测目标量变化大的样品和野外等简陋场合使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于化学分 析方法的

技术介绍
分子信标技术是生物分子探针研究的重点。它可以对PCR扩增产物进 行定量检测和对PCR扩增过程(real-time PCR)作实时在线检测;用于 基因的定量、定性检测和用于基因点突变等的分析和双链DNA的检测[文献 Du H， Disney MD, Miller BL， Krauss TD , J.Am. Chem. Soc., 2003， 125，4012-4013;(d) Marras，S.A.E.， Kramer，F.R. and Tyagi，S. Genet. Anal. Biomol. E,1999,14, 151-156;进行基础医学研究和直接应用于临床医学中对肿 瘤、SARS、乙肝病毒及艾滋病病毒等各种疾病的检测与诊断[文献Fan，C.， Plaxco， K. W., Heeger， A.， J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100, 9134-9137; (f) Douglas Horejsh, Federico Martini, Fabrizio Poccia, Giuseppe Ippolito， Nucleic Acids Res, 2005, 33, e13在医学、分子生物学、环境科学等诸多领域的 发展有着非常重要的意义。多数分子信标为荧光分子信标。由于荧光分子信标技术需要比较庞大、贵 重的检测仪器，不适用于一些比较简陋的工作场所及在野外应对突发事件如 生化袭击等需要野外作业的场合等。而电化学检测技术具有灵敏度高、选择性 好、简便价廉和易携带等优点。目前电化学分子信标通常采用以一端固定于电 极表面的电化学分子信标。其方法主要是通过改变电化学活性分子与电极表面 的距离来实现生物分子/电化学信号的转换，具有背景电流高，检测灵敏度低并且需要采用固定的方式，对大容 量的样品检测有困难等
技术实现思路
3针对已有检测技术存在的不足，本专利技术的目的在于推出一种用电化学活性 开关分子信标检测核酸的方法。该方法以电化学活性开关分子信标为检测探 针，无试剂，不需要固定，选择性好、灵敏、简便、快速直接均相测定核酸等 生物分子。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。该技术方案包括电化学活性开关分 子信标的合成和检测样品中特定序列的核酸分子的两个步骤。所述的分子信标 无电化学活性，但与目标分子结合后，因其茎环结构发生改变而具有电化学活 性，产生与溶液中的核酸的浓度呈线性关系的氧化峰电流。由此还可计算核酸 目标分子的含量。现详细描述本专利技术的技术方案。 一种用电化学活性开关分子信标检测核酸 的方法，其特征在于，具体操作步骤第一步电化学活性开关分子信标的合成每1.0 O.D核酸量合成时取30pL 3.3xl(T3！11011/1的胭脂红酸溶液和加入 20mg咪唑，调节该溶液的pH值至6.5，室温下羧基活化30分钟，在偶联剂 12mgEDC和27mgNHS存在下，加入含1.0 O.D两端修饰有氨基的具有茎环结 构特定序列核酸的PBS溶液，调节该PBS溶液的pH值至7.3和溶液体积为 400pL，在冰水浴下搅拌24小时，透析袋于PBS溶液中透析48小时，去除未 与核酸偶联的胭脂红酸，用HPLC方法提纯，得到浓度不低于lxl(rSmo11/1的 电化学活性丌关分子信标，4'C冰箱中保存备用；第二步检测样品中特定序列的核酸分子在含有待测的特定序列核酸溶液的样品中，加入50fiL lxlO-5molL—1的第 一步得到的电化学活性开关分子信标，控制溶液的杂交条件为PBS溶液的pH =7.3和 = 1.8mol/L， 50°C下杂交反应30分钟，采用羧基化碳纳米管修饰 电极在0.2 0.9V范围扫DPV，记录0.7V处的氧化峰电流值，该氧化峰电流 值与样品中特定序列核酸浓度呈线性关系。本专利技术的优点1、 采用电化学活性开关分子信标作为检测探针，无需其他试剂，不要固 定，方法简单、便捷。2、 釆用电化学检测，具有灵敏、选择性好，背景信号低，对样品无浊度 要求，所需仪器简单，价格便宜，适用于野外等简陋场合使用。3、 可在水溶液中对特定序列的核酸进行检测，并且检测的线性范围宽， 适用于目标量变化大的样品检测。具体实施例方式现结合实施例进一步说明本专利技术的技术方案和工作原理。实施例完全按照 上述检测核酸的方法的具体操作步骤进行操作。实施例溶液中人体生长因子促进剂(porpholilinogen deaminase from 170 to 142)序列的核酸测定第一步按3.0 O.D.核酸量的合成，取90pL 3.3x10—3mo11/1的胭脂红酸 溶液，加入约60mg咪唑，调节该溶液的pH值至6.5，室温下羧基活化30分 钟，在偶联剂12mgEDC和27mgNHS存在下，加入3.0 O.D.的两端修饰有氦 基的含porpholilinogen deaminase from 170 to 142互补序列的特定核酸片段 PBS溶液(pH=7.3),溶液体积为1200pL，混合液在冰水浴下搅拌24小时， 透析袋(分子量为7000)于PBS溶液中透析48小时，除去过量的未与核酸偶 联的胭脂红酸，用HPLC方法提纯，制得1100pL浓度为1.5x10—5111011/1的电 化学活性开关分子信标，4'C冰箱中保存备用。第二步在分别含有0.1， 0.3， 0.6, 0.9， 1.5 pmoll/1人体生长因子促进 齐ij ( porpholilinogen deaminase from 170 to 142)的特定序列目标核酸溶液中， 分别加入50nL lxl0—SmolL'1的的第 一 步得到的电化学活性开关分子信标，控 制溶液的杂交条件为pH=7.3 PBS和 = 1.8mol/L， 50。C下杂交反应30分 钟，采用羧基化碳纳米管修饰电极在0.2 0.9V范围扫DPV，记录0.7V处的 氧化峰电流值，该氧化峰电流值分别为0.32， 0.64， 1.16， 1.62， 2.75pA。经 计算，其线性方程为Y= 0.122+1.83C,式中Y为峰电流)iiA， C为目标核酸 浓度pmolL—1，相关系数为0.9986。 工作原理胭脂红酸为羟基蒽醌类化合物，在正、负电位下都有电化学响应。分别为-位于-0.4V附近的一对氧化还原峰，对应着胭脂红酸的蒽醌基团被还原成氢醌 及其逆反应，以及位于+0.720V的氧化峰，对应氢醌基团被氧化成二醌式结构 的过程。当电化学活性开关分子信标以环茎结构形式存在时，其处于闭合状态时， 由于其茎部末端的两个胭脂红酸分子靠得很近，其氢醌基团间形成稳定的分子 间氢键，从而使两个胭脂红酸分子缔合，缔合后的胭脂红酸分子处于更加稳定 的状态，不表现出电化学活性；而当电化学活性开关分子信标与互补的特定序 列核酸链作用并打开后，其构型的变化使末端的胭脂红酸分子被分开，此时胭 脂红酸分子的缔合状态被破坏，故能够表现出电化学活性。将胭脂红酸作为电 化学活性开关分子信标的信号分子，利用电化学活性开关分子信标与互补的特 定序列的核酸链作用后发生的构型改变，使胭脂红酸分子可在缔合状态和解离 状态间变化，从而令其具有在电化学非活性/活性间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用电化学活性开关分子信标检测核酸的方法，其特征在于，具体操作步骤：　第一步电化学活性开关分子信标的合成　每１．０　Ｏ．Ｄ核酸量合成时取３０μＬ　３．３×１０↑［－３］ｍｏｌＬ↑［－１］的胭脂红酸溶液和加入２０ｍｇ咪唑，调节该溶液的ｐＨ值至６．５，室温下羧基活化３０分钟，在偶联剂１２ｍｇＥＤＣ和２７ｍｇ　ＮＨＳ存在下，加入含１．０　Ｏ．Ｄ两端修饰有氨基的具有茎环结构特定序列核酸的ＰＢＳ溶液，调节该ＰＢＳ溶液的ｐＨ值至７．３和溶液体积为４００μＬ，在冰水浴下搅拌２４小时，透析袋于ＰＢＳ溶液中透析４８小时，去除未与核酸偶联的胭脂红酸，用ＨＰＬＣ方法提纯，得到浓度不低于１×１０↑［－５］ｍｏｌＬ↑［－１］的电化学活性开关分子信标，４℃冰箱中保存备用；　第二步检测样品中特定序列的核酸分子　在含有待测的特定序列核酸溶液的样品中，加入５０μＬ１×１０↑［－５］ｍｏｌＬ↑［－１］的第一步得到的电化学活性开关分子信标，控制溶液的杂交条件为ＰＢＳ溶液的ｐＨ＝７．３和［Ｎａ↑［＋］］＝１．８ｍｏｌ／Ｌ，５０℃下杂交反应３０分钟，采用羧基化碳纳米管修饰电极在０．２～０．９Ｖ范围扫ＤＰＶ，记录０．７Ｖ处的氧化峰电流值，该氧化峰电流值与样品中特定序列核酸浓度呈线性关系。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程圭芳，何品刚，黄翠华，张帆，林莉，吴继魁，方禹之，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]