本发明专利技术涉及一种测定５′－核苷酸酶活性的方法，同时本发明专利技术还涉及５′－核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷单磷酸、单价磷酸盐、腺苷脱氨酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶、稳定剂、还原型色原体组合，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况（速度），从而测算出５′－核苷酸酶的活性大小。采用本发明专利技术完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定5′-核苷酸酶活性的方法，同时本专利技术还涉及用于实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定
技术介绍
医学研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5′-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5′-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。5′-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5′-核苷酸酶活性。或者利用5′-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5′-核苷酸酶的活性。同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年专利技术的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出-种可以克服以上现有技术缺点的5′-核苷酸酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行5′-核苷酸酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术测定5′-核苷酸酶活性的步骤如下1)、将样品与主要由腺苷单磷酸、单价磷酸盐、腺苷脱氨酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应腺苷单磷酸+水5核苷酸酶腺苷+磷酸根腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子肌苷+磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸+过氧化氢尿酸+水+氧脲酶尿囊素+过氧化氢2过氧化氢+2还原型色原组合过氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。本专利技术应用5′-核苷酸酶偶联腺苷脱氨酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、脲酶、过氧化物酶等酶偶联反应以及还原型色原体(Chromogen)组合系统，将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此测量染料含量的高低(不同染料吸收波长不同，介于400--600nm之间)可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。这个酶偶联反应系统的优点有(1)它利用将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原或者吲嗒胺色原染料来反映5′-核苷酸酶活性，有精确度好的优点。(2)这个酶偶联反应系统组成的反应成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试结果精确。本专利技术的5′-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40--200mmol/l腺苷单磷酸 1--50mmol/l单价磷酸盐 0.2--10mmol/l腺苷脱氨酶 500--50000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黄嘌呤氧化酶500--50000U/l过氧化物酶 500--50000U/l脲酶500--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合0.1--20mmol/l以上还原型色原体组合可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone简称MBTH)或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)与0.1--20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸(phenol) N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine简称ESPAS)N，N-双乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-双氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid简称TBHB)3，5-双氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid简称DHBS)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium简称TOOS)仨溴羟基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)双甲基苯胺(Dimethylaniline简称DMA)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine简称EHSPT)2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)简称ABTS4-羟基-3-甲氢基苯甲酸(Vanilic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)简称HMB)3-甲基-乙基-羟基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline简称MEHA)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源腺苷、肌苷、次黄嘌呤、尿酸的污染试剂I缓冲液 40--200mmol/l 单价磷酸盐 0.2--10mmol/l腺苷脱氨酶 500--50000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/1黄嘌呤氧化酶500--50000U/l过氧化物酶 500--50000U/l脲酶500--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合(一)0.1--20mmol/l还原型色原体组合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。试剂II缓冲液 40--200mmol/l腺苷单磷酸 1--50mmol/l稳定剂 10--50mmol/l还原型色原体组合(二)0.1--20mmo l/l还原型色原体组合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四种成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种５′－核苷酸酶活性测定方法，步骤如下：１）、将样品与主要由腺苷单磷酸、单价磷酸盐、腺苷脱氨酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下方法原理的反应：腺苷单磷酸＋水５核 苷酸酶腺苷＋磷酸根腺苷＋水腺苷脱氨酶肌苷＋氨离子肌苷＋磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤＋１－磷酸核糖次黄嘌呤＋水＋氧黄嘌呤氧化酶尿酸＋过氧化氢尿酸＋水＋氧脲酶尿囊素＋过氧化氢 ２过氧化氢＋２还原型色原组合过氧化物酶２吲嗒胺色原或醌亚胺色原＋水２）、检测最终反应物在主波长４００－６００ｎｍ吸光度上升的速度，测算出５′－核苷酸酶的活性大小。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：王尔中，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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