肌酐含量测定方法及肌酐诊断试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种测定肌酐含量的方法，同时本发明专利技术还涉及肌酐诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷三磷酸、肌酐脱亚胺酶、Ｎ－甲基海因酶、丙酮酸、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、还原型辅酶、苹果酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况（速度），从而测算出肌酐的含量。采用本发明专利技术完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定肌酐含量的方法，同时本专利技术还涉及用于实现该方法的肌酐诊断试剂盒，属于医学检验测定

技术介绍
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。化学测定法——成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，因为维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。高效液相层析法(HPLC)——肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析，通常仅作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某些科研目的。毛细管电泳法——血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。酶学测定法——主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)两大类。检索发现，申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该专利技术所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物。当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该专利技术所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该专利技术的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物—还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的肌酐含量的测定方法，同时给出实现该方法的肌酐诊断试剂盒，采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行肌酐含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术测定肌酐含量的步骤如下1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、肌酐脱亚胺酶、N-甲基海因酶、丙酮酸、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、还原型辅酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应肌酐+水+H+肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。本专利技术应用肌酐脱亚胺酶偶联N-甲基海因酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶反应比色或连续监测法。肌酐脱亚胺酶水解肌酐产生N-甲基海因，然后N-甲基海因酶作用于N-甲基海因和腺苷三磷酸产生单磷酸盐，然后丙酮酸氧化酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用最后产生草酰乙酸，再通过偶联苹果酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(NADH、NADPH或其它类似物——在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(NAD+、NADP+或其它类似物——在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速(程)度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算肌酐的含量。虽然单磷酸盐在系统中被重复使用，但是最终的反应大小还是取决于最初的肌酐的含量大小所产生的初始单磷酸盐浓度决定。用以实现本专利技术方法的肌酐诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 0.2——20mmol/l肌酐脱亚胺酶1000——20000U/lN-甲基海因酶1000——20000U/l丙酮酸 1——10mmol/l丙酮酸氧化酶2000——20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l还原型辅酶 0.2——0.3mmol/l苹果酸脱氢酶2000——20000U/l稳定剂10——80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂试剂I缓冲液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 0.2——20mmol/lN-甲基海因酶1000——20000U/l丙酮酸 1——10mmol/l 丙酮酸氧化酶 2000——20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000——20000U/l还原型辅酶0.2——0.3mmol/l苹果酸脱氢酶 2000——20000U/l稳定剂 10——80％(总体积)试剂II缓冲液 40——200mmol/l肌酐脱亚胺酶 1000——20000U/l稳定剂 10——80％(总体积)双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，腺苷三磷酸、N-甲基海因酶、丙酮酸、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，肌酐脱亚胺酶也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。还可以将试剂配成如下三试剂，更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 0.2——20mmol/l丙酮酸 1——10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——20mmol/l还原型辅酶0.2——0.3mmol/l稳定剂 10——80％(总体积)试剂II缓冲液 40——200mmol/l N-甲基海因酶 1000——20000U/l丙酮酸氧化酶 2000——20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000——20000U/l苹果酸脱氢酶 2000——20000U/l稳定剂 10——80％(总体积)试剂III缓冲液 40——200mmol/l肌酐脱亚胺酶 10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肌酐含量测定方法，步骤如下：１）、将样品与主要由腺苷三磷酸、肌酐脱亚胺酶、Ｎ－甲基海因酶、丙酮酸、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、还原型辅酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下反应：肌酐＋水 ＋Ｈ↑［＋］肌酐脱亚胺酶Ｎ－甲基海因＋氨离子Ｎ－甲基海因＋水＋腺苷三磷酸Ｎ－甲基海因酶氨甲酰肌氨酸＋腺苷二磷酸＋磷酸根磷酸根＋丙酮酸＋氧＋水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸＋二氧化碳＋过氧化氢二氧化碳＋磷酸烯 醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸＋磷酸根草酰乙酸＋还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸＋辅酶２）、检测最终反应物在主波长３４０ｎｍ吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：王尔中，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]