本发明专利技术涉及一种测定肌酐含量的方法，同时本发明专利技术还涉及肌酐诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷三磷酸、辅酶、肌酐脱亚胺酶、Ｎ－甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况（速度），从而测算出肌酐的含量大小。采用本发明专利技术完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定肌酐含量的方法，同时本专利技术还涉及用于实现该方法的肌酐诊断试剂盒，属于医学检验测定
技术介绍
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。化学测定法——成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，因为维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。高效液相层析法(HPLC)——肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析，通常仅作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某些科研目的。毛细管电泳法——血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。酶学测定法——主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)两大类。检索发现，申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该专利技术所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物。当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该专利技术所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该专利技术的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物—还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的肌酐含量的测定方法，同时给出实现该方法的肌酐诊断试剂盒，采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行肌酐含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术测定肌酐含量的步骤如下1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、辅酶、肌酐脱亚胺酶、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应肌酐+水+H+肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨离子+碳酸氢根肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶过氧化氢+甲醛+甘氨酸甲醛+辅酶+水醛脱氢酶二氧化碳+过氧化氢+还原性辅酶+氢离子过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出肌酐含量的大小。通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出肌酐含量的大小。以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。本专利技术应用肌酐脱亚胺酶偶联N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脱氢酶、过氧化物酶等酶偶联反应以及还原型色原体(Chromogen)组合系统，将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此测量染料含量的高低(不同染料吸收波长不同，介于400--600nm之间)可以直接反映肌酐含量的大小。这个酶偶联反应系统的优点有(1)它利用将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原或者吲嗒胺色原染料来反映肌酐含量，有精确度好的优点。(2)这个酶偶联反应系统组成的反应成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试结果精确。实现本专利技术方法的肌酐诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 0.2--20mmol/l辅酶 0.5--20mmol/l肌酐脱亚胺酶 1000--20000U/lN-甲基海因酶 1000--20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000--10000U/l肌氨酸氧化酶 1000--20000U/l醛脱氢酶 500--50000U/l过氧化物酶 1000--50000U/l还原型色原体组合 0.1--20mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)以上还原型色原体组合可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone简称MBTH)或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)与0.1--20mmol/l以下十四种成分之一组合而成 石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine简称ESPAS)N，N-双乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-双氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid简称TBHB)3，5-双氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid简称DHBS)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium简称TOOS)仨溴羟基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)双甲基苯胺(Dimethylaniline简称DMA)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine简称EHS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肌酐含量测定方法，步骤如下：１）、将样品与主要由腺苷三磷酸、辅酶、肌酐脱亚胺酶、Ｎ－甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应：肌酐＋水 ＋Ｈ↑［＋］肌酐脱亚胺酶Ｎ－甲基海因＋氨离子Ｎ－甲基海因＋水＋腺苷三磷酸Ｎ－甲基海因酶氨甲酰肌氨酸＋腺苷二磷酸＋磷酸根氨甲酰肌氨酸＋水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸＋氨离子＋碳酸氢根肌氨酸＋氧＋水 肌氨酸氧化酶过氧化氢＋甲醛＋甘氨酸甲醛＋辅酶＋水醛脱氢酶二氧化碳＋过氧化氢＋还原性辅酶＋氢离子过氧化氢＋还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原＋水２）、检测最终反应物在主波长４００－－ ６００ｎｍ吸光度上升的速度，测算出肌酐含量的大小。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：王尔中，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。