本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的肌酐诊断／测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定肌酐浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、高铁细胞色素ｃ、氯化钙、肌酐脱亚胺酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的程度，从而测算出肌酐的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种肌酐诊断/测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定肌酐浓度的方法，属于医学检验测定
技术介绍
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。化学测定法成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。高效液相层析法(HPLC)，肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析，通常作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某些科研目的。检索发现，申请号为90106198.0、申请日为1990.12.18的中国专利申请公开了用高效液相色谱直接测定人尿中假尿嘧啶核苷(简称假尿苷)，再通过分光光度法同时测出肌酐，分别用假尿苷和假尿苷/肌酐作为鼻咽癌和肺癌的标志物。(这个专利和我们的无关)毛细管电泳法，血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。酶学测定法主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)两大类。检索发现，申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该专利技术所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该专利技术所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该专利技术的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物-还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二-->是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。据申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利介绍，该系统由于不断生成测定所需的NADH或NADPH，从而大大提高了试剂的稳定性，并大大降低试剂的生产成本。其实在试剂中加入NADH或NADPH的稳定剂已经不是困难或增加成本的问题，反而比在试剂中增加一个反应系统要经济得多。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定肌酐浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的肌酐诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行肌酐浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术肌酐浓度测定方法如下：肌酐+水 肌酐脱亚胺酶 N-甲基海因+氨氨+2水+6高铁细胞色素c 亚硝酸还原酶/Ca2+ 亚硝酸+ 6亚铁细胞色素c亚硝酸+水+辅酶 硝酸还原酶 硝酸+还原型辅酶这种方法应用肌酐脱亚胺酶(creatinine deaminase；EC 3.5.4.21)酶(偶)联亚硝酸还原酶(nitrite reductase；EC 1.7.2.2)、硝酸还原酶(nitrate reductase；EC1.7.1.1；EC 1.7.1.2；EC 1.7.99.4)酶促反应比色终点法。肌酐脱亚胺酶酶解肌酐反应产生氨，再通过(偶)联合亚硝酸还原酶、硝酸还原酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算肌酐的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术肌酐诊断/测定试剂(盒)较为理想：缓冲液 100mmol/L稳定剂 500mmol/L辅酶 3mmol/L肌酐脱亚胺酶 10000U/L亚硝酸还原酶 12000U/L硝酸还原酶 12000U/L高铁细胞色素c 12mmol/L氯化钙 5mmol/L本专利技术的肌酐诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：缓冲液、稳定剂、辅酶、肌酐脱亚胺酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素c、氯化钙。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，-->直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、高铁细胞色素c、氯化钙。试剂2缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶。辅酶、肌酐脱亚胺酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素c、氯化钙在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、高铁细胞色素c、氯化钙。试剂2缓冲液、稳定剂、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶。试剂3缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶。辅酶、肌酐脱亚胺酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素c、氯化钙在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定肌酐浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。具体实施方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。实施例一本实施例的肌酐诊断/测定试剂为单试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶比色法及酶联法的肌酐的浓度测定方法，其方法如下： 肌酐＋水肌酐脱亚胺酶Ｎ－甲基海因＋氨 氨＋２水＋６高铁细胞色素ｃ亚硝酸还原酶／Ｃａ↑［２＋］亚硝酸＋６亚铁细胞色素ｃ 亚硝酸＋水＋辅酶硝酸还原酶硝酸＋还原型辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的程度，测算出肌酐的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
1.一种酶比色法及酶联法的肌酐的浓度测定方法，其方法如下：肌酐+水肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨氨+2水+6高铁细胞色素c亚硝酸还原酶/Ca2+亚硝酸+6亚铁细胞色素c亚硝酸+水+辅酶硝酸还原酶硝酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，测算出肌酐的浓度大小测定结果。2.一种肌酐诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括：缓冲液 20——500mmol/L稳定剂 1——4000mmol/L辅酶 1——6mmol/L肌酐脱亚胺酶 1000——80000U/L亚硝酸还原酶 1000——80000U/L硝酸还原酶 1000——80000U/L高铁细胞色素c 1——50mmol/L氯化钙 1——50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。钙离子是亚硝酸还原酶的激活剂，因此氯化钙可用其它钙盐取代。其特征在于：试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。3.根据权利要求2所述肌酐诊断/测定试剂(盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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