一种用电化学活性开关适配体信标检测蛋白的方法，属于化学分析方法的技术领域，包括电化学活性开关适配体信标的合成和检测样品中特定蛋白分子的两个步骤。所述的适配体信标无电化学活性，但与目标分子结合后，因其茎环结构发生改变而具有电化学活性，产生与溶液中的蛋白的浓度呈线性关系的氧化峰电流。由此还可计算蛋白分子的含量。该方法以电化学活性开关适配体信标为检测探针，无试剂，不需要固定，选择性好、灵敏、简便、快速直接均相测定适配体等生物分子，检测的线性范围宽，特别适于检测目标量变化大的样品和野外等简陋场合使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及， 属于化学分析方法的
技术介绍
分子信标技术是生物分子探针研究的重点。它可以对PCR扩增 产物进行定量检测和对PCR扩增过程(real-time PCR)作实时在线 检测;用于基因的定量、定性检测和用于基因 点突变等的分析和双链DNA的检测[文献Du H, Disney MD, Miller BL， Krauss TD , J.Am. Chem. Soc.， 2003， 125,4012-4013; (d) Marras，S.A.E.， Kramer,F.R. and Tyagi,S. Genet. Anal. Biomol. E，1999,14， 151-156;进行基础医学研究和直接应用于临床医学中对肿 瘤、SARS、乙肝病毒及艾滋病病毒等各种疾病的检测与诊断[文献 Fan, C., Plaxco, K. W., Heeger, A.， J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003， 100, 9134-9137; (f) Douglas Horejsh, Federico Martini, Fabrizio Poccia, Giuseppe Ippolito， Nucleic Acids Res, 2005, 33， el3在医学、 分子生物学、环境科学等诸多领域的发展有着非常重要的意义。多数分子信标为荧光分子信标。由于荧光分子信标技术需要比较 庞大、贵重的检测仪器，不适用于一些比较简陋的工作场所及在野外 应对突发事件如生化袭击等需要野外作业的场合等。而电化学检测 技术具有灵敏度高、选择性好、简便价廉和易携带等优点。目前电化 学分子信标通常采用以一端固定于电极表面的电化学分子信标。其方 法主要是通过改变电化学活性分子与电极表面的距离来实现生物分子/电化学信号的转换[文献Fan, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.， 2003， 100,9134-9137; Wang, J.， Li， J., Baca， A. J.， Hu, J.， Zhou， F.， Yan， W., Pang， D,W., Anal.Chem.， 2003， 75, 3941-3945; S. S. W. YeungT. M. H. Lee., I. M. Hsing" J. Am. Chem. Soc.， 2006, 128, 13374-13375; A. E.Radi, J. L. A. Sa'nchez， E. Baldrich， C. K. O，Sullivan， J. Am. Chem. Soc., 2006， 128, 117-124.]，具有背景电流高， 检测灵敏度低并且需要采用固定的方式，对大容量的样品检测有困难 等。
技术实现思路
针对已有分析技术存在的不足，本专利技术的目的在于推出一种用电 化学活性开关适配体信标检测蛋白的方法。该方法以电化学活性开关 适配体信标为检测探针，无试剂，不需要固定，选择性好、灵敏、简 便、快速直接均相测定蛋白等生物分子。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。该技术方案包括电化学活 性开关适配体信标的合成和检测样品中特定蛋白分子的两个步骤。所 述的适配体信标无电化学活性，但与目标分子结合后，因其茎环结构 发生改变而具有电化学活性，产生与溶液中的蛋白的浓度呈线性关系 的氧化峰电流。由此还可计算蛋白目标分子的含量。现详细描述本专利技术的技术方案。 一种用电化学活性开关适配体信 标检测蛋白的方法，其特征在于，具体操作步骤第一步电化学活性开关适配体信标的合成每1.0 O.D核酸适配体量合成时取30pL 3.3xl(T3111011/1的胭脂红 酸溶液和加入20mg咪唑，调节该溶液的pH值6.5，室温下羧基活化 30分钟，在偶联剂12mgEDC和27mgNHS存在下，加入含1.0 O.D两 端修饰有氨基的具有茎环结构特定序列核酸的PBS溶液，调节该PBS 溶液的pH值至7.3和溶液体积为400pL，在冰水浴下搅拌24小时， 透析袋于PBS溶液中透析48小时，去除未与核酸偶联的胭脂红酸， 用HPLC方法提纯，得到浓度不低于lxlO'SmolL—1的电化学活性开关 适配体信标，4'C冰箱中保存备用；第二步检测样品中特定蛋白分子在含有待测的特定蛋白分子溶液的样品中，加入50^LlxlO—SmolL—1的第一步得到的电化学活性开关适配体信标，控制溶液 的培育条件为PBS溶液的pH=7.3、 = 1.0 mmoI/L和-1.0 mol/L， 37。C下培育30分钟，电化学检测以PBS溶液为电解液，采 用羧基化的碳纳米管修饰电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电 极，铂电极为对电极，用示差脉冲伏安法(DPV)进行检测，在0.2 0.9V 范围扫DPV，记录0.72V处的氧化峰电流值，该氧化峰电流与样品中 特定蛋白分子浓度呈线性关系。 本专利技术的优点1、 采用电化学活性开关适配体信标作为检测探针，无需其他试 剂，不要固定，方法简单、便捷。2、 采用电化学检测，具有灵敏、选择性好，背景信号低，对样 品无浊度要求，所需仪器简单，价格便宜，适用于野外等简陋场合使 用。3、 可在水溶液中对特定蛋白进行检测，并且检测的线性范围宽， 适用于目标量变化大的样品检测。具体实施例方式现结合实施例进一步说明本专利技术的技术方案和工作原理。实施例 完全按照上述检测蛋白的方法的具体操作步骤进行操作。 实施例溶液中凝血酶蛋白的测定第一步按3.0 O.D.核酸量的合成，取90nL 3.3xl(T3mo11/1的 胭脂红酸溶液，加入60mg咪唑，调节溶液pH值至6.5，室温下羧基 活化30分钟后，在偶联剂约12mgEDC和27mgNHS存在下，加入3.0 O.D.的两端带有氨基的含anti-thrombin aptamer (29mer)的核酸适配 体PBS溶液(pH=7.3)，溶液体积为1200pL，混合液在冰水浴下搅拌 24小时，透析袋(分子量为7000)于PBS溶液中透析48小时，除 去过量的未与核酸偶联的胭脂红酸，用HPLC方法提纯，制得1100pL 浓度为1.5xl(T5！11011/1的电化学活性开关适配体信标，4'C冰箱中保 存备用。第二步在分别含有1.0， 2.0， 4.0， 8.0， 12.0 xlO-HmolL"凝血 酶蛋白溶液中，分别加入50pL lxlO—SmolL—1的第一步得到的电化学 活性开关适配体信标，控制溶液的培育条件为PBS溶液的pH=7.3、 = 1.0 mol/L，37。C下培育30分钟，电化 学检测以PBS溶液为电解液，采用羧基化的碳纳米管修饰电极为工 作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，用示差脉冲伏 安法(DPV)进行检测，在0.2 0.9V范围扫DPV，记录0.72V处的氧 化峰电流值，该氧化峰电流值分别为0.24， 0.46， 0.79， 1.41, 2.18pA， 经计算，表明氧化峰电流与凝血酶蛋白浓度依从关系的线性方程为 Y=0.0861+0.1722C，式中，Y为氧化峰电流，单位为^A， C为凝血 酶蛋白浓度，单位为10—"molL—1，相关系数为0.9979。 工作原理胭本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用电化学活性开关适配体信标检测蛋白的方法，其特征在于，具体操作步骤： 第一步电化学活性开关适配体信标的合成 每１．０ Ｏ．Ｄ核酸适配体量合成时取３０μＬ３．３×１０↑［－３］ｍｏｌＬ↑［－１］的胭脂红酸溶液和加入２０ｍｇ咪唑，调节该溶液的ｐＨ值６．５，室温下羧基活化３０分钟，在偶联剂１２ｍｇＥＤＣ和２７ｍｇＮＨＳ存在下，加入含１．０ Ｏ．Ｄ两端修饰有氨基的具有茎环结构特定序列核酸的ＰＢＳ溶液，调节该ＰＢＳ溶液的ｐＨ值至７．３和溶液体积为４００μＬ，在冰水浴下搅拌２４小时，透析袋于ＰＢＳ溶液中透析４８小时，去除未与核酸偶联的胭脂红酸，用ＨＰＬＣ方法提纯，得到浓度不低于１×１０↑［－５］ｍｏｌＬ↑［－１］的电化学活性开关适配体信标，４℃冰箱中保存备用； 第二步检测样品中特定蛋白分子 在含有待测的特定蛋白分子溶液的样品中，加入５０μＬ１×１０↑［－５］ｍｏｌＬ↑［－１］的第一步得到的电化学活性开关适配体信标，控制溶液的培育条件为ＰＢＳ溶液的ｐＨ＝７．３、［Ｍｇ↑［２＋］］＝１．０ｍｍｏｌ／Ｌ和［Ｎａ↑［＋］］＝１．０ｍｏｌ／Ｌ，３７℃下培育３０分钟，电化学检测以ＰＢＳ溶液为电解液，采用羧基化的碳纳米管修饰电极为工作电极，Ａｇ／ＡｇＣｌ电极为参比电极，铂电极为对电极，用示差脉冲伏安法（ＤＰＶ）进行检测，在０．２～０．９Ｖ范围扫ＤＰＶ，记录０．７２Ｖ处的氧化峰电流值，该氧化峰电流与样品中特定蛋白分子浓度呈线性关系。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程圭芳，何品刚，黄翠华，张帆，林莉，吴继魁，方禹之，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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