本发明专利技术公开了一种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针及其构建方法和应用。本发明专利技术提供的HSV1-TK探针的制备方法，其步骤包括：（1）用限制性内切酶HindIII和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；（2）PCR扩增DnaE的C端，TK基因的C端，DEVD序列，TK基因的N端，蛋白内含子DnaE的N端；（3）通过基因重组技术将各个片段按一定顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组；（4）重组载体经过转化、提取质粒、酶切鉴定，获得HSV1-TK探针。本发明专利技术的分子影像探针可以活体监测细胞凋亡的发生发展，克服了电子显微镜或流式细胞术等技术只能在离体水平观察细胞凋亡的缺点，为活体监测提供了一个有利工具。
【技术实现步骤摘要】
—种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及的是一种检测细胞凋亡的HSVl-TK分子影像探针及其构建方法和应用。
技术介绍
细胞凋亡，是生物体内一种生理性的程序性细胞死亡过程，为细胞死亡的一种特殊方式(另一种为细胞坏死)，是细胞针对所处环境因素的特定改变而产生的应答。常规的细胞凋亡检测方法都为体外检测法，诸如电子显微镜形态学观察、DNA电泳、流式细胞术、酶联免疫吸附法等，但这些方法自身多少都存在局限性。比如，标本处理过程复杂，只能定性，不能定量，并且均具有创伤性，通常只能在某一特定时间点研究细胞凋亡，不能连续动态监测凋亡在活体内的发生与发展过程。分子成像可以无创、重复的提供活体、实时、动态、可视化的分子或基因信息，同时进行定量研究，所获得的数据与常规研究手段所得到的数据比较，更加接近机体的真实情况。近年来，随着分子影像技术的不断发展，人们逐渐将分子影像学应用于细胞凋亡研究，这种方法克服了体外细胞凋亡检测方法的局限性，为活体内细胞凋亡的基础与临床研究开创了一条全新的无创伤性研究手段。分子成像技术主要包括正电子发射计算机断层成像(Positron Emission Tomography, PET),单光子发射计算机断层成像(Single PhotonEmission Computed Tomography, SPECT),磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)，光学成像和超声分子成像等。然而，MRI和超声成像由于灵敏度较低，光学成像由于穿透力和断层分辨率较低，其应用受到一定限制。SPECT由于具有较低分辨率，其应用也受到一定限制。与其他分子成像技术相比，PET具有高灵敏度和断层分辨率、标记药物半衰期短且不改变原药物的药理活性等显著优点，从而称为活体内检测细胞凋亡的最佳技术。单纯疱疫病毒I 胸苷激酶(herpes simplex virusl-thymidinekinase, HSV1-TK)报告基因是应用较广的PET成像的分子探针。其原理基本为，正电子核素标记的核苷类似物如 18F_9_鸟嘌呤(18F_9_-guanine, 18F-FHBG)经主动运输通过HSVl-TK转染细胞后，被该基因的编码产物胸甘激酶(thymidine kinase, TK)磷酸化为5’-磷酸核苷,5’-磷酸核苷不能再次穿过细胞膜而陷入被转染细胞中。因而，细胞内的放射性活度反映了 TK基因的表达。因此，通过构建HSVl-TK的分子影像探针，可以通过PET成像活体内监测细胞凋亡的发生发展。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种新的基于HSVl-TK的分子影像探针及其构建方法，用于活体监测细胞凋亡的发生发展。本专利技术的技术方案如下:一种检测细胞凋亡的HSVl-TK分子影像探针的构建方法，包括以下步骤:(I)用限制性内切酶HindIII和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；(2) PCR扩增蛋白内含子DnaE的C端DnaEc、TK基因的C端TKc、TK基因的N端TKn、DnaE的N端DnaEn，以及公司化学合成DEVD序列，其序列为5’ -gatgaagtcgac-3’；(3)通过基因重组技术将上述各个片段DnaEc、TKc、DEVD、TKn、DnaEn依次与线性化的pcDNA3.1载体重组；(4)重组载体经过转化、提取质粒、酶切鉴定，获得HSVl-TK探针。所述的构建方法构建的检测细胞凋亡的HSVl-TK分子影像探针，其包含启动子、蛋白内含子DnaE的C端，TK基因的C端，DEVD序列，TK基因的N端，蛋白内含子DnaE的N端，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的HSVl-TK分子影像探针在活体监测细胞凋亡的发生发展中的应用。该分子探针的原理如下:图1所示，在体内首先经过转录、翻译为一条线性的肽链，然后在DnaE的作用下进行剪接从而形成一个环化的TK，这时TK的N端和C端连接在一起，但是并没有活性。在细胞受到外界刺激引起凋亡的情况下，caspase-3酶会切割DEVD位点从而形成一个线性的TK，但此时TK仍然没有活性。最后经过体内的蛋白自折叠形成正确的三维结构，TK具有活性，从而能被PET成像捕捉到信号，反映体内凋亡情况。本专利技术的分子影像探针可以活体监测细胞凋亡的发生发展，克服了电子显微镜或流式细胞术等技术只能在离体水平观察细胞凋亡的缺点，为活体监测提供了一个有利工具。【专利附图】【附图说明】图1为该HSVl-TK分子影像探针的工作原理图；图2为HSVl-TK分子影像探针的构建示意图；图3为细胞凋亡时HSVl - TK的活性测定结果；图4为westernblot检测分子影像探针的蛋白构象结果；【具体实施方式】以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例1构建HSVl-TK分子影像探针，图2所示:1.线性化载体:pcDNA3.1经过限制性内切酶HindIII和XhoI消化后，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下切下目的DNA片段。目的条带用胶回收试剂盒回收纯化。2.获得插入片段:DEVD序列的获得:从上海生工公司利用常规化学合成方法合成DEVD序列，其序列为 5，-gatgaagtcgac-3?；TKn和TKc序列的获得:分别PCR扩增HSV1-TK片段的N端和C端。为了降低TK在体内的毒性，其N端前面45个氨基酸序列没有扩增，而是从第46个氨基酸开始。经过生物信息学分析预测有3个潜在的位点，可以在此3个位点打断，从而插入DEVD序列。这三个位点是TK的第76位、266位和276位氨基酸位点。故扩增的TKn分别是从46-76，46-266，46-276 个氨基酸；TKc 分别是从 77-375，267-375，277-375 个氨基酸。最终得到的3个探针分别命名为cTK76，CTK266和cTK276.DnaEn和DnaEc序列的获得:分别PCR扩增DnaE全长片段的N端和C端。扩增DnaEc两端的引物I引入酶切位点Hindi 11和BamHI，扩增DnaEn两端的引物2引入酶切位点NotI和XhoI。扩增的程序为:在冰浴中，按以下次序将各成分加入到一无菌PCR-EP管中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测细胞凋亡的HSVl-TK分子影像探针的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)用限制性内切酶HindIII和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；(2)PCR扩增蛋白内含子DnaE的C端DnaEc、TK基因的C端TKc、TK基因的N端TKn、DnaE的N端DnaEn，以及公司化学合成D EVD序列，其序列为5’ -gatgaagtCgaC-3’；(3)通过基因重组技术将上述各个片段DnaEc、TKc、DEVD、TKn、DnaEn依次与线性化的pcDNA3.1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王福，王琰，武文娇，夏玉琼，曾琦，梁继民，田捷，
申请(专利权)人：西安电子科技大学，
类型：发明
国别省市：
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