本发明专利技术公开了一种用于在里氏木霉(Trichoderma?reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌。该表达设备从5’至3’依次包括以下元件：(1)控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；(3)多克隆位点；(4)控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子。将外源基因插入上述表达设备中，经T-DNA二元载体转化根瘤农杆菌，和里氏木霉接合，所得里氏木霉基因工程菌可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因，从中获得外源蛋白的大量生产。该里氏木霉培养条件粗放，适合固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，产生的胞外蛋白质易于分离纯化，成本低廉。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及一种用于在里氏木霉(Trichodermareesei) 细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌。
技术介绍
里氏木霉是在二战时期从所罗门群岛的棉制油布中分离得到的一种嗜温腐生性丝状真菌，具有良好的降解纤维素材料的能力。由于该菌由ReeseE. T.博士筛选鉴定，因此被命名为iTrichoderma reesei。作为工业菌株，Τ. reesei能够生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶等，其中一些里氏木霉突变株的胞外酶蛋白产量可达60g/L， 而最主要的纤维素酶CBHI (cellobiohydrolase I，纤维二糖水解酶I)，可以达蛋白分泌总量的50% (约30g/L)。里氏木霉作为工业生产菌株生产纤维素酶、半纤维素酶已有多年的历史，这些酶类被广泛应用于纺织、造纸、制浆等工业领域。除具有极好的合成和分泌蛋白的能力以外，T. reesei还具有真核的蛋白分泌机制和与哺乳动物系统相似的蛋白质翻译后修饰、加工性能，如高甘露糖型和N-糖基化。由于其适于蛋白生产的诸多优点，而且对人类没有毒性，里氏木霉也已成为相关研究人员开展真菌细胞学、遗传学和生理生化研究的重要生物材料。美国能源部(NOE)资助支持了里氏木霉基因组的测序工作，目前全基因组序列已经完成并公布。里氏木霉全基因组测序的完成为利用功能基因组学方法研究具有重要生物学意义的功能基因奠定了基础。农杆菌介导转化法是利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA将外源基因转移到真菌基因组中的方法。根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是近年来发展的一种新方法，与传统的转化方法相比，该方法操作简便，可导入大片段的DNA，转化效率高，导入基因大多是单拷贝，表达效果好，稳定遗传。基于上述优点，农杆菌介导的转化技术已成为目前真菌分子生物学研究中快速发展的转化方法，成为真菌系统突变分析的有效工具。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对外源蛋白表达量低，分离纯化困难的不足，提供一种操作简便快捷的用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备及其应用和所获得的里氏木霉基因工程菌，可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因。本专利技术的第一方面提供一种用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备，其中，所述的表达设备从5’至3’依次包括以下元件(1)控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子；( 控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；C3)多克隆位点；(4)控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子。本专利技术中，所述的启动子是能够控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子，较佳的为里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I启动子(p。bhI)，更佳的启动子的序列是序列表中 SEQ ID NO 18 所示。本专利技术中，所述的信号肽可以是本领域中能够控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的任何信号肽(分泌肽)，较佳的信号肽的编码序列为序列表中SEQ ID N0:1所示。本专利技术中，所述的多克隆位点可以是本领域各种常规的多克隆位点，较佳的多克隆位点序列是序列表中SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示。本专利技术中，所述的终止子是能够控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子 (T。bhI)，较佳的是里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I终止子，更佳的终止子的序列是序列表中SEQ ID NO 19所示。较佳的，所述的表达设备还包括以下元件( 筛选标记基因的表达盒，其位于元件(1)启动子的上游或元件(4)终止子的下游。本专利技术中，所述的筛选标记基因的表达盒能够在里氏木霉中表达各种本领域的常规筛选标记，较佳的，所述的筛选标记是新霉素磷酸转移酶、庆大霉素乙酰基转移酶、或潮霉素磷酸转移酶，较佳的筛选标记是潮霉素磷酸转移酶，其基因序列较佳的是GeneBank的登录号为Z32698. 1的第1437位位至第4057位所示。较佳的，所述的在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备还进一步包括外源蛋白的编码序列，其位于第⑶元件多克隆位点之中、之前或之后。所述的外源蛋白是指来源于里氏木霉以外的蛋白，包括动物、植物和真菌的蛋白。本专利技术中，较佳的，所述的表达设备还进一步包括第二个多克隆位点，该第二个多克隆位点位于第(4)元件终止子和第( 元件筛选标记基因的表达盒之间。本专利技术第二方面提供一种含有上述任何一种表达设备的载体，较佳的是根瘤农杆菌二元载体，如 T-DNA 表达载体 pPZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、 或pPK2，但不限于这些载体，更佳的选自ρΡΖΡ201ΒΚ、ρΒΙ121、或pCAMBIA。本专利技术第三方面提供一种含有上述任何一种载体的宿主细胞，较佳的是根瘤农杆菌 LBA4404、GV2260、C58C1、GV3100、A136、GV3101、GV3850、AGL-1、EHAlOl、EHA105，更佳的是根瘤农杆菌GV3101。本专利技术第四方面提供一种表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，其基因组中含有任何一种如上所述的表达设备。所述的里氏木霉属于里氏木霉种，较佳的是里氏木霉 Trichoderma reesei QM6a、QM9414、QM 9123、Sa28、QM 9136、NRRL 3653、ME-446、DB746、 4065MG4、4065MG5、NRRL 3652、或NRRL 11236，更佳的是里氏木霉 Trichoderma reesei RUT C30。本专利技术第五方面提供一种该表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌的制备方法包括，将上述含有外源蛋白基因的表达设备的根瘤农杆菌二元载体转化根瘤农杆菌，将所得的根瘤农杆菌转化子和里氏木霉接合，挑选基因组中整合有外源蛋白基因的表达设备的接合子，即为表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌。该里氏木霉基因工程菌可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因。本专利技术第六方面提供一种生产蛋白的方法，包括培养所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，从培养物中获得该外源蛋白。本专利技术的里氏木霉基因工程菌可应用于制备工业酶制剂、饲料添加剂和蛋白质药物。所述酶制剂为中性纤维素内切酶、纤维二糖酶、β葡萄糖苷酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶。本专利技术所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果1、本专利技术的里氏木霉表达设备在一环化质粒上，易于保存和DNA操作。2、本专利技术的里氏木霉表达设备利用农杆菌结合转移技术，可提高转化效率，缩短操作时间和工作量。3、本专利技术的里氏木霉表达设备具有优化的分泌表达能力，适合大多数异源基因的分泌表达。4、本专利技术的里氏木霉表达设备的多克隆位点中含有稀有接口，兼容绝大多数异源基因的连接，节约操作时间提高工作效率。5、本专利技术的基因工程菌可以作为纤维素酶诱导剂筛选的灵敏指示剂。6、本专利技术的基因工程菌可高效表达中性纤维素酶，在造纸业和纺织业具有很重要的应用。7、本专利技术提供的表达设备，可实现来源于动物、植物和真菌的异源蛋白质基因在丝状多细胞真核微生物里氏木霉中的高效分泌表达。由于里氏木霉培养条件粗放，适用于固体培养和液体深层发酵；里氏木霉本身没有毒性，在产酶条件下本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于在里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）细胞内表达外源蛋白的表达设备，其特征在于，所述的表达设备从５’至３’依次包括以下元件：（１）控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子；（２）控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；（３）多克隆位点；（４）控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子。
【技术特征摘要】
1.一种用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备，其特征在于，所述的表达设备从5’至3’依次包括以下元件(1)控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；(3)多克隆位点；(4)控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子。2.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述的启动子是里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I启动子(P。bhI)；所述的终止子是里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I 终止子。3.如权利要求1或2所述的表达设备，其特征在于，所述的表达设备还包括以下元件 (5)筛选标记基因的表达盒，(5)筛选标记基因的表达盒，其位于元件⑴启动子的上游或元件(4)终止子的下游。4.如权利要求1 3任一项所述的表达设备，其特征在于，所述的在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备还进...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏东芝，王玮，吕丹丹，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31
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