一种重组人柯萨奇病毒b组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种编码重组人柯萨奇病毒B组蛋白的重组DNA，提供了一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白，提供了一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白的制备方法，提供了一种检测人柯萨奇病毒B组感染的试剂盒，以及提供了一种将所述重组人柯萨奇病毒B组蛋白用于检测人柯萨奇病毒B组感染的用途。本发明专利技术的重组DNA具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，本发明专利技术提供的重组人柯萨奇病毒B组蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人柯萨奇病毒B组感染临床诊断的需要。

【技术实现步骤摘要】
—种重组人柯萨奇病毒B组蛋白及其应用
本专利技术涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种编码重组人柯萨奇病毒B组蛋白的重组DNA，一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白及其应用。
技术介绍
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种肠病毒(enteroviruses),分为A和B两类，是常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒。感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰质炎性病变，并致胎儿宫内感染和致畸。柯萨奇病毒A组有23型病毒，B组有6型病毒。通过型特异性抗原，经中和试验，ELISA方法等可以对各型进行鉴定。柯萨奇病毒所有的B组及A组的第9型有共同的组特异性抗原，在B组内病毒之间有交叉反应，但是A组病毒没有共同的组特异性抗原。A组某些型别的型特异性抗原可在37 °C引起人类O型红细胞凝集反应。柯萨奇B组病毒(coxsackievirusgroupB,CVB)感染自1954年在美国纽约州柯萨奇镇发生及被报道以来，除引起新生儿散发感染外，也陆续在世界的某些地区发生了多次流行。主要侵犯免疫力低下的围生儿。柯萨奇B组病毒包括柯萨奇BI，柯萨奇B2，柯萨奇B3，柯萨奇B5几种病毒。柯萨奇B组病毒是微小RNA病毒科肠道病毒属成员，病毒性心肌炎的病例中大约有20%-25%是由柯萨奇B组病毒引起。CVB的致病机制十分复杂，病毒基因组以及病毒蛋白均在病毒致病过程中发挥重要作用。因此，对柯萨奇B组病毒的基因组、结构蛋白以及某些非结构蛋白与靶细胞内分子间相互作用生物信息的认识是阐述该病分子机制的基础。实验室检查是本病早期和确定诊断的主要依据，主要包括病毒分离，血清学特异性抗体的检测等。但分离培养耗时长，必须在早期进行分离才能提高病原体的阳性检出率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种编码重组人柯萨奇病毒B组蛋白的重组DNA，提供一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白，提供一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白的制备方法，提供一种检测人柯萨奇病毒B组感染的试剂盒，以及提供一种将所述重组人柯萨奇病毒B组蛋白用于检测人柯萨奇病毒B组感染的用途。本专利技术提供了一种编码重组人柯萨奇病毒B组蛋白的重组DNA，该重组DNA的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。本专利技术提供了一种包含所述重组DNA的人柯萨奇病毒B组蛋白的表达载体，它是将权利要求1所述的重组DNA插入到质粒pET-30a上得到的重组pET-30a_C0XB质粒，其质粒图谱如附图2所示。 本专利技术提供了一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白，它由所述重组DNA编码，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。本专利技术提供了一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白的制备方法，包括以下步骤:I)获得具有SEQIDN0:1所示核苷酸序列的重组DNA ；2)将所述重组DNA导入质粒，构建表达载体；3)将所得到的重组质粒导入原核宿主细胞；；4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞，表达由所述重组DNA编码的重组人柯萨奇病毒B组蛋白；5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。所述原核宿主细胞是大肠杆菌细胞，优选BL21 (DE3)菌株。所述质粒优选为pET_30a质粒。上述步骤4)中的培养条件为:37°C培养3小时后(转速200r/min)，加入诱导剂(终浓度为lmmol/mL)，37°C诱导表达5小时(转速200r/min)。本专利技术提供了一种表达重组人柯萨奇病毒B组蛋白的工程菌株，该菌株含有所述表达载体pET-30a_C0XB,该工程菌株是大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-30a_C0XB,其菌种保藏号为CGMCCN0.88 92，该菌株于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。本专利技术提供了一种检测人柯萨奇病毒B组感染的试剂盒，其组分中的抗原是本专利技术所述的重组人柯萨奇病毒B组蛋白，用于标记所述重组人柯萨奇病毒B组蛋白的标记物选自胶体金或辣根过氧化物酶(HRP )。本专利技术所述的采用胶体金标记抗原的试剂盒中，抗人IgG抗体划线包被浓度为1.0mg/ml, COXB抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫,抗人IgG抗体划线量为1.0 μ 1/cm，胶体金结合物喷点量为60.0μ 1/cm2，羊抗鼠IgG抗体包被量为1.0 μ Ι/cm,包被浓度为 1.0mg/ml。本专利技术提供了一种将所述的重组人柯萨奇病毒B组蛋白用于检测人柯萨奇病毒B组感染的用途。以下将更详细的描述本专利技术的技术方案:本专利技术公开了一种编码重组人柯萨奇病毒B组蛋白的重组DNA，该重组DNA如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，利用该重组DNA制备重组人柯萨奇病毒B组蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQIDN0:2所示氨基酸序列的重组人柯萨奇病毒B组蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测人单纯疱疹病毒感染方面的用途。具有SEQIDN0:1所示核苷酸序列的重组DNA可以通过本领域常规的方法制备。选择其强抗原表位，即柯萨奇病毒B4基因组(Genbank:AFR79234.1，菌株为JX308222.1)中DNA序列为模板，设计两对PCR引物(Pl，P2)和(P3，P4)。引物Pl和P2用于扩增片段I，引物P3和P4用于扩增片段2，引物Pl和P4分别带有BamHI和XhoI的酶切位点，并共同对应于目的片段的5’末端3’末端，引物p2和p3顺序互补。引物序列如下:Pl:5，-GCTACTCATGGCTCGGGATCCGAAATGCAATCAGC-3’P2:5， -CACAGATGACTCACCCGTGGCTGCGTTCT-3’P3:5， -GAACGCAGCCACGGGTGAGTCATCTGTGGAG-3’P4:5，-ATACTCGAGTTAACCCTCAGTCCAAAAGAT-3’由于选取了亲水性较强的序列，本专利技术对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。本专利技术的一个实施方案涉及应用具有如SEQIDN0:1所示的核苷酸序列的重组DNA制备重组人柯萨奇病毒B组蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码重组人柯萨奇病毒B组蛋白的如SEQIDN0:1所示核苷酸序列的重组DNA分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本专利技术的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。编码本专利技术蛋白的重组DNA与pET_30a质粒形成的重组质粒具有高度的稳定性，有利于本专利技术的蛋白的表达。在本专利技术的一个实施方案中，如图2所不,制备含有SEQIDN0:1所不核苷酸序列的重组DNA分子和pET-30a质粒的表达构建体，并将该构建体转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导培养后，收集菌体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。本专利技术的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的重组人柯萨奇病毒B组蛋白，该蛋白具有SEQIDN0:2所不氣基酸序列。本专利技术的一个实施方案涉及包含本专利技术人柯萨奇病毒B组蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人柯萨奇病毒B组感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码重组人柯萨奇病毒B组蛋白的重组DNA，其特征在于该重组DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.包含权利要求1所述重组DNA的人柯萨奇病毒B组蛋白的表达载体，其特征在于它是将权利要求1所述的重组DNA插入到质粒pET-30a上得到的重组pET-30a_C0XB质粒。3.一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白，其特征在于它由权利要求1所述重组DNA编码，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。4.一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白的制备方法，包括以下步骤: 1)获得具有SEQIDN0:1所示核苷酸序列的重组DNA； 2)将所述重组DNA导入质粒，构建表达载体； 3)将所得到的重组质粒导入原核宿主细胞；； 4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞，表达由所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀杰，华艳，张晓刚，
申请(专利权)人：北京英诺特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：