检测RET基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测RET基因突变的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测RET基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测RET基因突变的方法，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术提供的检测RET基因突变的引物组，包括用于检测RET基因多个外显子的引物对中的一种或两种以上，检测全面，应用广泛。本发明专利技术提供的用于检测RET基因突变的试剂，包括本发明专利技术提供的引物组，检测快速，准确。本发明专利技术提供的用于检测RET基因突变的试剂盒，包括本发明专利技术提供的引物组或试剂，能够快速、准确地检测RET基因的突变，灵敏度高、特异性强。本发明专利技术提供的检测RET基因突变的方法，操作简单，成本低廉，耗时短，临床应用范围广。

【技术实现步骤摘要】
检测RET基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测RET基因突变的方法
本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及一种检测RET基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测RET基因突变的方法。
技术介绍
原癌基因RET(REarrangedduringTransfection；OMIM：164761)定位于人类染色体10q11.2，全长80kb，含21个外显子(约长55kb)，其剪接变异体包含RET基因的第1～19外显子，并带有独特的3’末端序列。RET编码1114个氨基酸的酪氨酸激酶受体，主要在神经内分泌细胞、泌尿生殖系统和中央或外周神经细胞系统中表达。RET蛋白属于细胞表面分子，包括胞外区、跨膜区和胞内区功能域，与胶质细胞衍生神经营养因子(glial-derivedneurotropicfactor，GDNF)家族的配体：GDNF、neurturin、persephin和artemin相互作用，转导细胞分化和生长的信号。RET基因在体内和体外均能通过细胞遗传学重排激活成为致癌基因。种系水平RET突变(获得功能突变)可导致起源于神经嵴细胞的多发性内分泌腺瘤2型(Multipleendocrineneoplasiatype2，MEN2)的发生，目前已发现超过166种RET变异体，其中70余种RET突变体可引起MEN2的发生。MEN2包括2种亚型：2A型(MEN2A；占95％)和2B型(MEN2B；占5％)。发病率约为1/30000。经典型MEN2A的临床主要表现为2种或以上特定的内分泌肿瘤：甲状腺髓样癌(medullarythyroidcarcinoma，MTC；95％～100％)、肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PHEO；50％)和甲状旁腺功能亢进(hyperparathyroidism，HPT；20％～30％)。少部分MEN2A患者伴发肩背部区域(T2～T6)瘙痒性皮肤苔藓淀粉样变(cutaneouslichenamyloidosis，CLA；9％)或伴先天性巨结肠症(hirschsprungdisease,HSCR；7％)，或仅患有MTC且不伴其它内分泌腺肿瘤的家族性MTC(familialmedullarythyroidcarcinoma，FMTC；15％)。MEN2B患者很早就表现为侵袭性MTC，其他症状包括PHEO(50％)、舌前背、腭、咽黏膜神经节瘤(70％～100％)和胃肠道弥漫性神经节瘤(40％～90％)、眼部异常(上睑缘外翻，泪液分泌减少)和角膜增厚(60％～90％)和Marfan样体征(75％)或可伴发无临床意义的甲状旁腺瘤/增生。与MEN2相关的RET突变绝大多数为杂合性种系突变，极少数为纯合子或双突变、多位点突变，突变热区主要集中于RET基因的第5、8、10、11、13-16外显子：(1)在约98％的MEN2A家系可见种系水平的RET基因第10和11外显子突变，其中约87％以上的突变发生在RET基因第11外显子第630(C630F/R/S/Y)、634(C634F/G/R/S/W/Y)位密码子点突变；其余突变多发生在第10外显子第609位(C609F/G/R/S/Y)、第611位(C611F/G/R/S/W/Y)、第618位(C618F/G/R/S/Y)和第620位(C620F/G/R/S/W/Y)密码子，即半胱氨酸被置换。在约95％的FMTC家系和7％的散发性MTC患者中可见种系水平的RET基因突变，典型的是第609位、第611位、第618位、第620位和第634位密码子突变，其中第618位、第620位和第634位的突变各占20％～30％。其余的突变发生在第5、8、13-16外显子，又以第768位和第804为密码子为常见。(2)MEN2B患者RET基因突变约95％为第16外显子的M918T，4％为第15外显子的A883F突变。这些特异的RET基因突变型转化甲状腺C细胞增生进展至MTC的活力呈现明显的年龄相关性，即突变型转化活力强的，MEN2-MTC侵袭性更强、发病年龄更早，其MTC的诊断年龄和外显率较PHEO更早或更高，反之亦然。RET突变基因型和临床表型呈现出很好的相关性。1)第10外显子第609、611、618、620位和第11外显子第630、634位密码子是FMTC和MEN2A最常见的突变位点，且常为半胱氨酸残基的错义突变。RET基因半胱氨酸残基替换导致在未与配体结合下使RET单体通过二硫键自身聚合，形成畸变的同源二聚体，启动胞内酪氨酸残基磷酸化，异常激活酪氨酸蛋白激酶活性(RET蛋白二聚体的激酶活性至少是单体的10倍)。2)第13外显子第768、790、791位密码子、第14外显子第804、819、833、844和15外显子第866、891位密码子等。胞内区突变常为非半胱氨酸密码子突变；上述位点突变导致的激酶自身磷酸化活性较低、转化能力较弱，往往与FMTC表型密切相关，仅见少部分突变与其他MEN2A亚型相关。3)同为胞内区的RET基因第15外显子A833F和第16外显子M918T突变主要与MEN2B有关。这类突变具有超强的激酶活性和激活大多以单体形式的受体转化活性，导致底物结合区构象的改变、不适当底物磷酸化刺激信号转导途径，使正常RET基因不能参与这一信号转导途径。4)其他，可见于RET基因的5号外显子(V292M)和8号外显子(c.1585_1593dupGAGGAGTGT；G533C)可导致MEN2A或FMTC。依据MEN2的表型可做出临床诊断，但MEN2的精准诊断需基于种系RET突变检测，后者是诊断MEN2的金标准，也是与散发MTC/PHEO/HPT的本质区别所在。国际MTC诊治指南：美国甲状腺协会(ATA)-2015、欧洲甲状腺协会(ETA)-2012和美国国家癌症网(NCCN)-2010均推荐对所有首诊MTC患者进行RET突变检测，对突变者的其他家族成员进行RET突变筛查：(1)MTC患者其一生中进行一次RET突变检测可明确是不是MEN2；(2)循MEN2患者进行家系调查和RET突变筛查，可发现RET突变者在没有出现MEN2临床症状前得以早期明确诊断；(3)依据RET突变危险分级整合血清降钙素水平等，对MEN2患者实施早期个体化精准治疗或监视随访；(4)有别于无症状散发MTC患者，大多限于体检发现或并经穿刺活检病理明确诊断后才进行治疗；(5)5.6％～9％的MEN2A为DenovoRET突变，90％的MEN2B为DenovoRET-M918T所致，有利于此部分原先考虑“散发MTC”诊断的修正及其子代的及时治疗或监视；(6)MEN2相关伴随疾病的及早准确诊治；(7)有利于MEN2的预防。因此加强MTC/PHEO等患者的RET基因筛查(分子诊断)，进行遗传咨询指导，积极采取临床早期干预措施及其综合规范治疗，有效实践转化医学和精准医疗，可最大限度减少MEN2的临床危害。目前，对RET基因突变的检测方法相对复杂，使用效率相对较低。因此，开发一种能够快速、准确、有效的检测RET基因突变的试剂盒及操作简单的检测方法尤为重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种检测RET基因突变的引物组，本专利技术的第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测RET基因突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下7个引物对中的至少一个引物对，所述7个引物对为：用于检测RET基因第5外显子的引物对，用于检测RET基因第8外显子的引物对，用于检测RET基因第10外显子的引物对，用于检测RET基因第11外显子的引物对，用于检测RET基因第13外显子的引物对，用于检测RET基因第14外显子和/或第15外显子的引物对以及用于检测RET基因第16外显子的引物对；所述用于检测RET基因第5外显子的引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第8外显子的引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第10外显子的引物对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第11外显子的引物对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第13外显子的引物对包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第14外显子和/或第15外显子的引物对包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第16外显子的引物对包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。...

【技术特征摘要】
1.一种检测RET基因突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下7个引物对中的至少一个引物对，所述7个引物对为：用于检测RET基因第5外显子的引物对，用于检测RET基因第8外显子的引物对，用于检测RET基因第10外显子的引物对，用于检测RET基因第11外显子的引物对，用于检测RET基因第13外显子的引物对，用于检测RET基因第14外显子和/或第15外显子的引物对以及用于检测RET基因第16外显子的引物对；所述用于检测RET基因第5外显子的引物对包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第8外显子的引物对包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第10外显子的引物对包括SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第11外显子的引物对包括SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第13外显子的引物对包括SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第14外显子和/或第15外显子的引物对包括SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的核苷酸序列；所述用于检测RET基因第16外显子的引物对包括SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚晓平，李鹏飞，
申请(专利权)人：中国人民解放军第一一七医院，上海祥音生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33