一种多肽衍生化方法及其在MALDI‑TOF‑MS检测药物代谢物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种化学衍生化基质辅助激光解析电离‑飞行时间质谱技术(MALDI‑TOF‑MS)的分析方法。本发明专利技术首先使用二醛类化合物对含有氨基结构药物代谢物进行修饰，使得药物代谢代谢物能够衍生出带有醛基的基团，再使用多肽对醛基衍生物进行衍生化，通过MALDI‑TOF‑MS检测。将药物代谢产物多肽化后能够得到简洁单一的准分子离子峰，不仅显著改善了这些代谢产物在质谱中的辨识度，也极大的提高了药物代谢物在质谱中检测灵敏度。该方法灵敏度高、应用范围广、操作便捷、基质干扰极小、样品需求量低，无需制备附在的基质和衍生化试剂，即可定量检测代谢物中含量极低的氨基代谢产物。在代谢组学研究中有很大的应用前景。

The application of a biochemical method in MALDI TOF peptide derivatives and drug metabolites in MS detection

The invention discloses a chemical derivatization matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI TOF MS) analysis method. The invention firstly uses two aldehyde compounds containing amino modified the structure of the drug metabolites, the drug metabolism metabolites can be derived with aldehyde groups, then use the derivatization of peptide aldehyde derivatives were detected by MALDI TOF MS. The drug metabolite polypeptides can get single molecular ion peaks is simple, not only significantly improves the identification of these metabolites in the spectrum, but also greatly improves the detection sensitivity of drug metabolites in mass spectrometry. The method has high sensitivity, wide application range, convenient operation, matrix interference minimum, low sample requirement, without preparation of the matrix and derivatization of amino metabolites can be detected in very low metabolite. It has a great prospect in metabonomics research.

【技术实现步骤摘要】
一种多肽衍生化方法及其在MALDI-TOF-MS检测药物代谢物中的应用
本专利技术涉及质谱检测领域，具体的为利用多肽衍生化代谢产物，结合MALDI-TOF-MS的方法及其在代谢组学领域的应用。
技术介绍
代谢组学是继基因组学和蛋白组学之后，又一表征生命体系状况的研究领域，生物体内的代谢物的检测对研究基因表达、探索生命过程、诊断疾病和预防疾病等方面都具有深刻意义。因此，对代谢物分析是分析化学领域，乃至生命科学领域中的一个重要方向。质谱作为小分子代谢物研究的重要手段，具有灵敏度高、专一性好、定性能力强等显著优点。目前对小分子代谢物最常见的质谱检测技术是液相色谱-质谱联用。虽然LC-ESI-MS的灵敏度高，但是LC-MS的检测时间长，不适用与快速高通量分析。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)由于检测快速、简便、高通量等特点，被广泛应用于DNA、蛋白质、多肽、多糖等大分子样品的检测。考虑到MALDI-TOF-MS检测的快速、简便、高灵敏度、高通量等优势，我们尝试将其拓展到对小分子代谢物的检测。MALDI-DOF-MS虽然在检测大分子物质上具有显著的优越性，但不适合检测代谢物这种小分子物质，主要是由于其通常所用的基质CHCA、DHB、3-HPA、2,4,6-THP等在小分子(<500Da)区段会对目标分析物有严重的基质干扰。为克服这一缺点，现有文献报道的方法主要分为两类：1)采用基质干扰小的基质，比如多孔硅、纳米微球、金属氧化物、碳材料等，但依然没有一种方便、广泛适用于基质被开发出来；2)设计大分子衍生化试剂衍生小分子待测物，现有文献报道的衍生化试剂的制备通常很繁琐和一定局限性。因此，在小分子化学物MALDI-TOF-MS分析中迫切需要发展一种简便的、高灵敏度、普适的衍生方法。本专利技术针对上述问题，首次开发以多肽作为衍生化试剂来衍生小分子代谢物的新型MALDI-TOF-MS检测手段，从而克服MALDI-TOF-MA在小分子物质检测方面的优势，开拓MALDI-TOF-MS在代谢组学检测领域的应用。具有操作简便、快速、样品用量少等优点，特别适用于生物样品的分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种能应用于小分子代谢物检测领域中，结合化学衍生化策略的具有高灵敏度和普适性的MALDI-TOF-MS分析方法；本专利技术提供的衍生化技术和分析方案包括如下步骤：(1)通过PM3方法对多肽进行分子模拟和计算后，筛选到用于衍生化的多肽，该多肽含有在MALDI源中易电离的精氨酸、苯丙氨酸等基团；(2)步骤(1)获得的多肽衍生待测小分子物质，使这些小分子带上易电离的氨基酸残基链。本专利技术通过将含有氨基的化合物通过二醛衍生化，再通过分子模拟筛选出高灵敏度的多肽作为衍生化试剂，用N端修饰半胱氨酸和马来酰亚胺的多肽分别衍生醛类化合物类化合物，再用MALDI-TOF-MS检测这些经过多肽标记的小分子代谢物。一种衍生化方法：采用序列为CFRGLRGF的多肽P2和序列为KFRGLRGF(Lys上修饰马来酰亚胺)的多肽P7分别作为醛类物质的衍生化试剂，水作为反应溶剂，磷酸缓冲溶液作为缓冲剂；反应条件为：醛类化合物/多肽P2(20-100，c/c)加入到pH5-7的磷酸缓冲溶液中，4-37℃下衍生0.2-2h；所述的衍生化反应是指含有Cys的多肽与醛类化合物发生的脱水缩合反应。优选地，醛类化合物、多肽P2以摩尔比为50:1加入到pH为4的磷酸缓冲溶液中，25℃下，发生脱水缩合反应，5h。由于所述的多肽衍生化试剂带有容易在MALDI-MS中结合质子发生电离的氨基酸残基，包括Arg(精氨酸)，Phe(苯丙氨酸)等，发现筛选出的多肽具有较高的质子亲和势，从而在质谱中容易结合质子，具有高灵敏度。一种多肽化衍生结合MALDI-TOF-MS的定量分析方法：将小分子待测物衍生化后，与相应的稳定同位素内标1:1混匀，按照1μL待测液混合1μL基质(CHCA)点板；室温吹干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析，根据目标分析物谱峰强度与稳定同位素谱峰强度的比值对其进行定量分析。所述的多肽化衍生法结合MALDI-TOF-MS的分析方法在代谢组学分析领域中的应用：经筛选用于衍生化的多肽含有在MALDI源中易电离的Arg(精氨酸)、Phe(苯丙氨酸)基团，标记待测小分子物质后可以使这些小分子带入易电离的氨基酸残基链，显著增强它们在MALDI-TOF-MS中的电离化效率，从而导致方法的灵敏度得到极大的提高。由于多肽在MALDI-TOF-MS中的最低检出限(LOD)可以达到fmol，多肽衍生的小分子待测物在质谱中的LOD也可以达到fmol级别。而且，这种多肽化衍生策略可应用许多其他小分子化学物的检测，除了专利技术中所述的醛类化合物外，还可以拓展到酮类、羧酸类、醇酚类、酯类等小分子化合物的MALDI-TOF-MS分析中，这些小分子化合物的检测对代谢组学的研究意义重大。本专利技术的有益效果如下：1.本专利技术中，方法操作简便，待测物标记后直接用MALDI-TOF-MS分析。2.本专利技术设计的多肽化衍生方法可以显著提高小分子待测物在MALDI-TOF-MS中的检测灵敏度(灵敏度比衍生之前提高了50000倍)，检出限可达到fmol级别。3.本专利技术用到的多肽衍生化试剂使待测小分子带上了分子量很大的标记物，避免了MALDI-TOF-MS中低分子区段(<500Da)基质效应对检测的干扰。4.本专利技术涉及的多肽及同位素多肽都可以购买到商品化的产品，利用定量分析。5.本专利技术设计的衍生化反应具有较高的普适性，由于衍生化试剂多肽上有许多可供修饰的基团，利用多种小分子化合物的分析，具有很高的应用前景。具体实施方式1.工作溶液的配置：将衍生化的多肽溶于水中，配置成100μM的溶液备用，阿霉素代谢物的醛类衍生物待测物溶解于水货甲醇中配置成储备液。2.醛基化代谢产物的制备，将代谢产物与二醛类化合物，按照摩尔比为1:1.2的比例溶解在醇类溶剂中，加入1滴冰醋酸，50℃下搅拌反应，旋干溶剂备用。3.多肽化衍生物方法为：将多肽衍生化试剂盒待测物溶解在水溶液中或其他溶剂，按照适当的配比加入到一定pH的磷酸缓冲液中，使待测物在反应体系中的浓度为10μM，涡旋混合后在适宜的温度下进行衍生化反应。衍生化条件为醛类化合物：多肽P2(20-100，c/c)加入到pH为4-6的磷酸缓冲溶液中，25-37℃下衍生化1-10小时。4.衍生化反应结束后，将产物溶液与稳定同位素内标溶液混合，涡旋混匀后，按照1μL样品混合1μL基质(CHCA)点板；室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，采用正离子反射模式分析。5.步骤4中所述的稳定同位素内标制备方法为，将稳定同位素多肽P2(多肽亮氨酸上的N和6个C标记)，与过量的醛基化合物进行衍生化后，真空旋干，以除去过量小分子，再复溶于水中职称内标液。6.步骤4中所述的质谱检测条件为：Waters公司的基质辅助解析电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。MALDI-MS分析采用波长为337nm的氮气激光器，其脉冲宽度为3ns，采用20kV的加速电压，在正离子反射模式下进行检测。每张谱图是200次激光扫描的平均结果。实施例1阿霉素经醛基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽衍生具有化氨基代谢结构小分子化合物结合MALDI‑TOF‑MS的方法，其特征包括以下步骤：(1)小分子化合物：以二醛类化合物为连接臂，通过缩合反应修饰至氨基化合物上，使药物代谢产物结构衍生出醛基基团。(2)多肽衍生化小分子化合物：将醛类化合物、多肽以摩尔比50‑100:1加入到pH为4‑6的磷酸缓冲液中，在5‑37℃下发生缩合反应，多肽的氨基酸序列N端半胱氨酸修饰，作为醛类化合物衍生化试剂。(3)MALDI‑TOF‑MS分析：样品衍生化按照1μL样品混合基质α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸CHCA点板，室温风干后进行基质辅助激光解析电离‑飞行时间质谱，采用正离子反射模式。

【技术特征摘要】
1.一种多肽衍生具有化氨基代谢结构小分子化合物结合MALDI-TOF-MS的方法，其特征包括以下步骤：(1)小分子化合物：以二醛类化合物为连接臂，通过缩合反应修饰至氨基化合物上，使药物代谢产物结构衍生出醛基基团。(2)多肽衍生化小分子化合物：将醛类化合物、多肽以摩尔比50-100:1加入到pH为4-6的磷酸缓冲液中，在5-37℃下发生缩合反应，多肽的氨基酸序列N端半胱氨酸修饰，作为醛类化合物衍生化试剂。(3)MALDI-TOF-MS分析：样品衍生化按照1μL样品混合基质α-氰基-4-羟基肉桂酸CHCA点板，室温风干后进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，采用正离子反射模式。2.根据权利要求1所述的醛基衍生化方法其特征在于，二醛类化合选自乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、己二醛、庚二醛、辛二醛。二醛类化合物与代谢产物的反应溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇，反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐春雷，冯柏年，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32