用于制备核酸的等温方法及相关组合物技术

根据本发明专利技术的一些方面，提供了用于核酸测序的制备方法及相关组合物。在一些实施方案中，本文的方法提供了在等温条件下模板核酸的快速扩增，以产生可直接用于标准下一代核酸测序系统的样品，所述测序系统包括：例如，基于高通量流动池的测序系统。在一些实施方案中，本发明专利技术的一些方面涉及用于制备核酸的方法，所述方法涉及在等温条件下指数扩增核酸，以用于测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备核酸的等温方法及相关组合物
技术介绍
下一代测序技术近来的进步已经导致研究和临床环境中测序及制备方法的快速增加。高通量能力及高涵盖深度使下一代测序成为分子诊断中有吸引力且有前景的方向。作为全基因组测序的替代，可以探寻(interrogate)基因的特定子集并可以将多个样品合并(例如，多重地)入单个测序运行(例如，流动池泳道(flowcelllane))，因此减低了分析的整体成本。目前的方法仍然限速，并且对改善的方法有所需求。
技术实现思路
本专利技术的一些方面涉及这样的认识，即用于制备用于测序的核酸的现存方法既是劳动密集的，又经常需要大量的起始材料。还已经认识到，现存方法涉及的步骤(例如连接步骤、末端修复以及多腺苷酸加尾)既冗长又低效，使得这些方法无法用于获取快速且精确的测序结果，而这是分子诊断背景中所需的。在一些实施方案中，本文的方法提供了在等温条件下快速扩增模板核酸，以产生可直接用于标准下一代核酸测序系统的样品，所述系统包括例如高通量基于流动池的测序系统。在一些实施方案中，本专利技术的一些方面涉及用于制备核酸的方法，该方法包括在等温条件下指数扩增核酸以用于测序。因此，在一些实施方案中，本文所提供的方法是有优势的，因为其利用了等温反应条件，规避了对专门的温度循环机器的需求。在一些实施方案中，本文所提供的方法是有优势的，因为可以使用RNA和/或DNA作为起始材料利用所述方法。因此，在一些实施方案中，可以使用提取自多种不同类型的样品(例如，血液以及其他组织样品，包括获取自病理学分析的样品)的核酸利用所述方法，从而使得能够对通常组织样品进行平行诊断测试。在一些实施方案中，已经认识到传统的制备方法经常不仅依赖于温度循环(例如，如用PCR)，而且依赖于不变的、已知的序列，以设计靶区域侧翼的扩增引物。在一些实施方案中，这限制了使用现存方法所捕获到的遗传事件的类型，使得检测由超突变、基因重排或者与未知遗传伴侣融合所导致的核酸变体成为挑战。因此，在一些实施方案中，本文所提供的方法可用于制备用于以检测大范围基因变体、重排或多态性为目的之测序的核酸。例如，在一些实施方案中所提供的方法对于扩增核酸模板是有优势的，所述核酸模板包含与未知序列融合的已知靶序列，以达到鉴定未知序列的目的。因此，在一些实施方案中，本文所提供的方法可用于制备由基因重排导致的核酸融合。在一些实施方案中，所述融合为已进行了染色体重排的基因中所编码的mRNA融合。在一些实施方案中，所述融合为含有由于染色体重排而已经融合在一起的两个基因座的染色体区段。因此，在一些实施方案中，本文所提供的制备方法可用于以对核酸进行测序为目的而扩增核酸库以检测基因组重排或融合。在一些实施方案中，本文所提供的方法可以用于检测基因组重排或融合，该方法使用测序作为标准病理学测定(例如，荧光原位杂交测定)的补充诊断测试。在一些实施方案中，本文所提供的制备方法可用于新式基因组装(例如鸟枪法测序)。在这样的实施方案中，具有杂交序列的寡核苷酸可以用于扩增含有基因组组装片段之间(例如，重叠群之间)连接的核酸。因此，在一些实施方案中，制备方法可以用于通过扩增含有基因组组装片段之间连接的核酸来确认基因组组装预期的正确性，从而确定该片段任一侧的实际序列，并确认该实际序列是否符合基因组组装预期。本专利技术的一些方面涉及制备用于分析的核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)由核酸模板产生合成RNA；(b)在等温反应中指数扩增所述合成RNA；以及(c)由所述指数扩增的合成RNA产生cDNA，其中所述cDNA包含至少一条非靶序列。本专利技术另一些方面涉及确定核酸模板序列的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)由核酸模板产生合成RNA；(b)在等温反应中，指数扩增所述合成RNA；(c)由所述指数扩增的合成RNA产生cDNA；以及(d)对所述cDNA进行测序。在某些实施方案中，重复步骤(b)的指数扩增。在一些实施方案中，在步骤(b)的每个连续轮(round)后纯化所述扩增的合成RNA，并且将所述纯化的合成RNA用作步骤(b)后续轮的起始材料。在某些实施方案中，重复的步骤(b)的至少两个等温反应包括由寡核苷酸引发(prime)的模板依赖性延伸，所述寡核苷酸具有与所述模板合成RNA或第一DNA链的嵌套序列(nestedsequence)互补的杂交序列。在一些实施方案中，所述等温反应包括模板依赖性延伸和RNA聚合酶转录的两个或更多个循环。在某些实施方案中，每个循环中的至少一次模板依赖性延伸为反转录。在一些实施方案中，所述等温反应在35℃至45℃范围的温度下进行。在某些实施方案中，所述等温反应所进行的持续时间为45分钟至90分钟。在一些实施方案中，所述等温反应包括合成第一DNA链的模板依赖性延伸，所述第一DNA链与所述合成RNA互补，从而导致在所述第一DNA链和所述合成RNA之间形成RNA-DNA杂交体。在某些实施方案中，所述等温反应还包括所述RNA-DNA杂交体中所述合成RNA部分的降解。在一些实施方案中，所述降解为酶促介导的降解。在某些实施方案中，所述降解由RNA酶H介导。在一些实施方案中，所述等温反应还包括合成第二DNA链的模板依赖性延伸，所述第二DNA链与所述第一DNA互补，从而导致形成包含所述第一和第二DNA链的双链DNA。在一些实施方案中，所述等温反应还包括RNA聚合酶介导的转录反应，所述转录反应由所述双链DNA转录合成的RNA。在一些实施方案中，重复的步骤(b)的至少两个等温反应包括由寡核苷酸引发的模板依赖性延伸，所述寡核苷酸具有与所述模板合成RNA或第一DNA链互补的杂交序列以及附加的非互补序列。在某些实施方案中，所述附加的非互补序列包含一个或更多个条形码序列(barcodesequence)、索引序列(indexsequence)或接头序列(adaptersequence)。在一些实施方案中，所述方法还包括通过使用包含靶特异性杂交序列的寡核苷酸进行至少一次延伸反应产生所述核酸模板；以及使用多个不同的寡核苷酸进行至少一次延伸反应，所述不同的寡核苷酸共有位于不同杂交序列5’的共同序列(commonsequence)。在某些实施方案中，所述核酸模板包含靶区域和邻接区域(adjacentregion)。在一些实施方案中，所述靶特异性杂交序列与所述靶区域互补，并且其中所述不同杂交序列的至少一条与所述邻接区域互补。在某些实施方案中，所述靶区域包含第一基因的序列，并且所述邻接区域包含第二基因的序列。在一些实施方案中，所述第一基因为RET、ROS1或ALK。在某些实施方案中，所述核酸模板为包含启动子的双链DNA，其中通过RNA聚合酶酶促产生所述合成RNA，所述RNA聚合酶特异性地与所述启动子结合，并转录所述启动子下游的DNA。在一些实施方案中，所述RNA聚合酶为T3、T7或SP6聚合酶。在某些实施方案中，由从所述核酸模板产生的中间双链DNA转录所述合成RNA，其中所述核酸模板为分离的RNA。在一些实施方案中，所述分离的RNA为信使RNA(messageRNA，mRNA)、微RNA(microRNA)、核糖体RNA、转移RNA或非编码RNA。在某些实施方案中，所述mRNA为由包含基因重排的染色体区段编码的融合本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：(a)由核酸模板产生合成RNA；(b)在等温反应中，指数扩增所述合成RNA；以及(c)由所述指数扩增的合成RNA产生cDNA，其中所述cDNA包含至少一条非靶序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.27 US 61/931,9741.制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：(a)由核酸模板产生合成RNA；(b)在等温反应中，指数扩增所述合成RNA；以及(c)由所述指数扩增的合成RNA产生cDNA，其中所述cDNA包含至少一条非靶序列。2.确定核酸模板序列的方法，所述方法包括：(a)由核酸模板产生合成RNA；(b)在等温反应中，指数扩增所述合成RNA；(c)由所述指数扩增的合成RNA产生cDNA；以及(d)对所述cDNA进行测序。3.权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述等温反应包括模板依赖性延伸和RNA聚合酶转录的两个或更多个循环。4.权利要求3所述的方法，其中每个循环中的至少一次模板依赖性延伸为反转录。5.权利要求3或4所述的方法，其中所述等温反应在35℃至45℃范围的温度下进行。6.权利要求5所述的方法，其中所述等温反应所进行的持续时间为45分钟至90分钟。7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述等温反应包括合成第一DNA链的模板依赖性延伸，所述第一DNA链与所述合成RNA互补，从而导致在所述第一DNA链和所述合成RNA之间形成RNA-DNA杂交体。8.权利要求7所述的方法，其中所述等温反应还包括所述RNA-DNA杂交体中所述合成RNA部分的降解。9.权利要求8所述的方法，其中所述降解为酶促介导的降解。10.权利要求9所述的方法，其中所述降解由RNA酶H介导。11.权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述等温反应还包括合成第二DNA链的模板依赖性延伸，所述第二DNA链与所述第一DNA互补，从而导致形成包含所述第一和第二DNA链的双链DNA。12.权利要求11所述的方法，其中所述等温反应还包括RNA聚合酶介导的转录反应，所述转录反应由所述双链DNA转录合成的RNA。13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中重复步骤(b)。14.权利要求13所述的方法，其中在步骤(b)的每个连续轮后纯化所述扩增的合成RNA，并且将所述纯化的合成RNA用作步骤(b)后续轮的起始材料。15.权利要求14所述的方法，其中重复的步骤(b)的至少两个所述等温反应包括由寡核苷酸引发的模板依赖性延伸，所述寡核苷酸具有与所述模板合成RNA或第一DNA链的嵌套序列互补的杂交序列。16.权利要求14或15所述的方法，其中重复的步骤(b)的至少两个等温反应包括由寡核苷酸引发的模板依赖性延伸，所述寡核苷酸具有与所述模板合成RNA或第一DNA链互补的杂交序列以及附加的非互补序列。17.权利要求16所述的方法，其中所述附加的非互补序列包含一个或更多个条形码序列、索引序列或接头序列。18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其还包括通过使用包含靶特异性杂交序列的寡核苷酸进行至少一次延伸反应产生所述核酸模板；以及通过使用多个不同的寡核苷酸进行至少一次延伸反应，所述不同的寡核苷酸共有位于不同杂交序列5’的共同序列。19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述核酸模板包含靶区域和邻接区域。20.权利要求19所述的方法，其中所述靶特异性杂交序列与所述靶区域互补，并且其中所述不同杂交序列的至少一条与所述邻接区域互补。21.权利要求19或20所述的方法，其中所述靶区域包含第一基因的序列，并且所述邻接区域包含第二基因的序列。22.权利要求21所述的方法，其中所述第一基因为RET、ROS1或ALK。23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述核酸模板为包含启动子的双链DNA，其中通过RNA聚合酶酶促产生所述合成RNA，所述RNA聚合酶特异性地与所述启动子结合，并转录所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔舒阿·斯塔尔，贾森·迈尔斯，
申请(专利权)人：阿谢尔德克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US