用于生产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株、制备方法及用途技术

本发明专利技术提供了一种吩嗪‑1‑甲酰胺(PCN)的基因工程菌株及其制备方法和用途。该基因工程菌株可由如下方法制备而得：敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467及其衍生物中的pykA基因，即得。该基因工程菌株的制备方法包括如下步骤：引物设计、重组质粒构建和突变菌株筛选。与现有技术相比，本发明专利技术具有如下的有益效果：采用全新的调控策略，改变细胞内代谢物质流向，大幅度提高了PCN的产量；该基因工程菌株安全可靠，稳定性好，可显著促进PCN的工农业应用。

For the genetic engineering strain, the production of phenazine 1 formamide preparation method and application thereof

The invention provides a phenazine 1 formamide (PCN) gene engineering strain and its preparation method and application thereof. The gene engineering strains can be prepared by the following steps: knockdown of Pseudomonas chloroaphis (Pseudomonas chlororaphis) pykA gene HT66 CCTCC NO:M 2013467 and its derivatives, i.e.. The method for preparing the genetic engineering strain comprises the following steps: primer design, construction of recombinant plasmids and screening of mutant strains. Compared with the prior art, the invention has the following advantages: the new control strategy, change the metabolism flow inside the cell, greatly enhanced the production of PCN; the gene engineering strain is safe and reliable, good stability, can significantly promote PCN industrial and agricultural applications.

【技术实现步骤摘要】
用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株、制备方法及用途
本专利技术涉及一种高产吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的基因工程菌株、制备方法及其用途，属于基因工程

技术介绍
到目前为止，科学家已经发现了超过6000种包含吩嗪结构的化合物，它们中绝大多数都是化学合成的，从生物体内分离得到的还不到100种。但是从生物体内分离到的吩嗪化合物多具有广谱的抗细菌、真菌等植物、动物病源菌的能力。例如，吩嗪-1-羧酸(PCA)能够抑制引起小麦根部腐蚀的小麦全蚀病，吩嗪-1-甲酰胺则对西红柿枯萎病等病原菌有显著的抑制作用，而有些吩嗪衍生物则显示出了在医药领域的用途，已经有越来越多的学者正在研究其作用机理。天然吩嗪化合物多产自细菌，人工培养时在合适的条件下它们中多能大量合成并分泌吩嗪及其衍生物，产量在毫克每升到克每升的水平。这些优良性能都显示了吩嗪及其类似物大规模推广应用的巨大潜力。假单胞菌中吩嗪的合成和调控基因均较为保守。早在1970年代，使用放射性同位素标记法已经发现吩嗪的生物合成途径与分枝酸(Shikimicacid)途径有密切的关系(TurnerJM,MessengerAJ.Occurrence,biochemistryandphysiologyofphenazinepigmentproduction.AdvMicrobPhysiol,1986,27：211-275)。通过对比不同吩嗪产生菌的合成序列发现，吩嗪的合成至少需要编码PhzA、PhzD、PhzE、PhzF和PhzG蛋白的基因。多数吩嗪合成基因簇还包含一个编码3-脱氧-a-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，DAHP)合成酶PhzC的基因，它可以催化分树酸途径的第一步，使DAHP脱磷酸进而环化成苯环，经脱水、加氢反应形成莽草酸，进一步被修饰形成分支酸。PhzC可促使初级代谢产物向吩嗪合成方向转化，其所催化的反应与芳香簇氨基酸合成途径类似。整个吩嗪基因座除包含一套由7个基因组成的吩嗪合成基因外，还存在复杂的代谢调控网络。在假单胞菌中，吩嗪次级代谢产物的调控可分为转录调控(Transcriptionalcontrol)和转录后调控(Post-transcriptionalcontrol)两部分。比如群感应调节系统，在荧光与绿针假单胞菌中这两个基因被命名为phzI/phzR，并直接位于吩嗪合成基因的上游。中国专利ZL200610023459.9通过改变铜绿假单胞菌M18中全局调控子gacA基因的表达，大幅提高了吩嗪-1-羧酸的产量。本课题申报的专利ZL201310566864.5，通过敲除绿针假单胞菌HT66中吩嗪合成的调控基因psrA或rpeA基因，也显著提高了吩嗪-1-甲酰胺的产量。由于微生物细胞内的代谢调控网络复杂，不同调控基因相互作用，仅依靠改变调控基因，难以进一步提高次级代谢产物的产量。本专利技术专利旨在通过敲除代谢途径的结构基因，改变细胞中相关物质的代谢流向，从而使中间代谢产物朝着吩嗪合成的方向积累，从而促进吩嗪类次级代谢产物的合成。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种高产PCN的基因工程菌株及其制备方法和用途。本专利技术是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术提供了一种高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，是敲除了绿针假单胞菌(Psedunomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467及其衍生物基因组中的pykA基因，即得。作为优选方案，所述pykA基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。作为优选方案，所述pykA基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。第二方面，本专利技术提供了一种如前述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的制备方法，包括插入突变法和无痕敲除法。作为优选方案，所述插入突变法敲除pykA基因包括如下步骤：S1、扩增pykA基因片段，并插入pEX18Tc质粒中；S2、扩增卡那霉素或庆大霉素等抗性基因，插入pykA基因中间，使pykA基因发生插入突变；S3、将突变后的pykA基因与HT66基因组中的pykA基因发生同源重组，根据抗性筛选出阳性克隆，即可。作为优选方案，所述无痕敲除pykA基因法包括如下步骤：A1、扩增pykA基因片段的上下游同源臂；A2、融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中；A3、使重组质粒上的pykA基因的上下游同源臂片段与HT66基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可。第三方面，本专利技术还提供了一种用于培养前述的基因工程菌株的培养基，其包括如下组分：甘油、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、磷酸氢二钾。作为优选方案，所述的培养基包括按重量份数计的如下组分：第四方面，本专利技术又提供了一种如前述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株在生产吩嗪-1-甲酰胺中的用途。其中，所述基因工程菌株在制备吩嗪-1-甲酰胺时的条件为：好氧培养；温度：28～32摄氏度；pH：6～8；转速200～350rpm。。本专利技术的基本原理为：pykA是编码丙酮酸激酶的基因，在不同种属的微生物中相对比较保守。丙酮酸激酶是糖酵解途径中的一个关键酶，可以催化磷酸基团的转移将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化成丙酮酸从而进入TCA循环或其他途径。由于PEP和丙酮酸处于细胞内糖、氨基酸和脂代谢的关键位置，且PEP是莽草酸合成途径中的初始底物之一(赤藓糖-4-磷酸(E4P)是另一个底物)，莽草酸途径的终产物分支酸是吩嗪-1-甲酰胺(PCN)合成的直接底物，故敲除pykA基因能够减弱PEP转化成丙酮酸的反应，使更多的碳源流向莽草酸途径，从而提高PCN产量。因此，与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：采用全新的调控策略，改变细胞内代谢物质流向，大幅度提高了PCN的产量；该基因工程菌株安全可靠，稳定性好，可显著促进PCN的工农业应用。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为不同菌株中pykA基因扩增产物的电泳图(L1为空白对照，L2:以野生株HT66的基因组为模板，L3:以突变株HT66ΔpykA的基因组为模板)；图2为野生株HT66与突变菌株HT66ΔpykA的生长曲线对比图；图3为不同菌株中pykA基因扩增产物的电泳图(L1为空白对照，L2:以菌株P3的基因组为模板，L3:以突变株P3ΔpykA的基因组为模板)图4为菌株P3和突变株P3ΔpykA的生长曲线对比图；图5为野生株HT66和突变株HT66ΔpykA的PCN发酵曲线；图6为菌株P3和突变菌株P3ΔpykA的PCN发酵曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。本专利技术的绿针假单胞菌(Psedunomonaschlororaphis)HT66，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，敲除了绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M2013467及其衍生物基因组中的pykA基因，即得。

【技术特征摘要】
1.一种高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，敲除了绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467及其衍生物基因组中的pykA基因，即得。2.如权利要求1所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述pykA基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述pykA基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种如权利要求1、2或3所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的制备方法，其特征在于，敲除所述pykA基因的方法为插入突变法或无痕敲除法。5.如权利要求4所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的制备方法，其特征在于，所述插入突变法敲除pykA基因包括如下步骤：S1、扩增pykA基因片段，并插入pEX18Tc质粒中；S2、扩增卡那霉素或庆大霉素等抗性基因，插入pykA基因中间，使pykA基因发生插入突变；S3、将突变后的p...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭华松，张雪洪，金雪洁，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31