用于生产L‑精氨酸的棒状杆菌属微生物和使用其的L‑精氨酸生产方法技术

本发明专利技术涉及一种用于生产L‑精氨酸的棒状杆菌属微生物和使用其的L‑精氨酸生产方法。

For L arginine production method and the production of L arginine Corynebacterium microorganism

The invention relates to a method for L arginine production method and the production of L arginine Corynebacterium microorganism.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产L-精氨酸的棒状杆菌属微生物和使用其的L-精氨酸生产方法
本专利技术涉及一种具有生产L-精氨酸能力的棒状杆菌属微生物和使用其生产L-精氨酸的方法。
技术介绍
L-精氨酸为广泛用于氨基酸补充剂、药物、食品等中的氨基酸，并且需要开发在相关行业中高效的L-精氨酸生产。通过常规生物发酵法生产L-精氨酸的方法是直接从碳源和氮源生产L-精氨酸的方法，且已报道了各种方法，包括使用由短杆菌或棒状杆菌属微生物诱导的修饰菌株的方法、使用通过细胞融合而成为具有增强的氨基酸生产能力的细菌细胞系的方法等。最近，报道了使用遗传重组菌株的方法，其中抑制精氨酸生物合成操纵子argR的表达的基因被灭活(美国专利号7,160,705)，以及使用argF在精氨酸操纵子中过表达的方法(韩国专利号10-0854234)等。特别地，控制精氨酸操纵子的argR中的缺失已被认为是精氨酸生产中的重要因素。根据迄今已知的事实，在棒状杆菌属微生物中，参与精氨酸生物合成的argCJBDFR基因以操纵子的形式构成，并且通过细胞内精氨酸进行反馈抑制(VeharySakanyan等，微生物学，142:9-108，1996)，因此对其高产量L-精氨酸生产施加了限制。
技术实现思路
技术问题因此，本专利技术的专利技术人在致力于提高L-精氨酸产量的同时，发现L-精氨酸可以通过增强精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶的活性，在通常已知为重要因素的精氨酸阻遏物(argR)中没有任何缺失的情况下，以比亲本L-精氨酸生产菌株更高产量地生产L-精氨酸，从而完成本专利技术。技术问题本专利技术的目的为提供一种具有生产L-精氨酸能力的棒状杆菌属微生物。本专利技术的另一个目的为提供使用棒状杆菌属微生物生产L-精氨酸的方法。技术效果可以使用根据本专利技术的具有增强活性的精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF或ArgF2)的生产L-精氨酸的棒状杆菌属微生物以较高产率来生产L-精氨酸。此外，以高产率生产的L-精氨酸可以有效地用于人类药物和药物工业。具体实施方式在实现上述目的的一方面，本专利技术提供一种具有增强活性的精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶的、能够生产L-精氨酸的棒状杆菌属微生物。在本专利技术中，精氨酸操纵子是由参与L-精氨酸生物合成机制的酶组成的操纵子，特别地，精氨酸操纵子由构成L-精氨酸生物合成的循环步骤的酶组成。具体地，精氨酸操纵子由N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)、N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(ArgD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和精氨酸阻遏物(ArgR)组成，这些酶参与L-精氨酸生物合成的连续酶反应。构成精氨酸操纵子的这些酶使用L-谷氨酸作为前体参与最终的L-精氨酸生物合成。N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)使用L-谷氨酸作为前体合成N-乙酰谷氨酸，且其可以为由argJ基因编码的。特别地，乙酰基是通过将N-乙酰鸟氨酸分解成L-鸟氨酸而获得的。已知N-乙酰谷氨酸转移酶参与属于棒状杆菌属的微生物中L-精氨酸生物合成的再循环反应。生产的N-乙酰谷氨酸通过N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)被合成为N-乙酰谷氨酰磷酸，ADP通过消耗ATP作为辅酶生产，且可以为由argB基因编码的。由于已知由最终产物L-精氨酸进行反馈抑制，通过L-精氨酸释放反馈抑制的修饰是已知的，并且有报道使用其可以提高L-精氨酸的生产率(中国专利号102021154和氨基酸.2012年7月；43(1)：255-66.doi：10.1007/s00726-011-1069-x.Epub2011年9月8日)。N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)在大肠杆菌或酵母中也称为乙酰谷氨酸半醛脱氢酶，且可以由argC基因编码。通过该酶将N-乙酰谷氨酰磷酸转化为N-乙酰谷氨酸5-半醛。NADPH用作辅酶以提供能量。使用L-谷氨酸作为氨基酸供体，将生产的N-乙酰谷氨酸5-半醛转化为N-乙酰鸟氨酸，并且该反应由乙酰鸟氨酸转氨酶(ArgD)介导。乙酰鸟氨酸转氨酶可由argD基因编码。转化的N-乙酰鸟氨酸通过N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)的再循环反应，将其乙酰基递送至L-谷氨酸，并作为L-鸟氨酸反应。鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)通常称为鸟氨酸氨甲酰水解酶，并且可以由argF或argF2基因编码。L-鸟氨酸与氨基甲酰磷酸结合以形成L-瓜氨酸，并生产作为副反应产物的磷酸酯。通过上述的与精氨酸操纵子分开存在的精氨基琥珀酸合酶(ArgG)和精氨基琥珀酸裂解酶(ArgH)的酶反应，最终将生产的L-瓜氨酸合成为L-精氨酸。L-精氨酸通过总共8个生物合成步骤来合成，在本专利技术中，通过强化精氨酸操纵子(argCJBDFR)的活性来诱导L-精氨酸生产率的增强。构成精氨酸操纵子的酶可以包括在本专利技术的范围内，只要它们具有上述活性，具体地，酶可以为来自棒状杆菌属微生物的蛋白质。更具体地，N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)可以包括SEQIDNO：19的氨基酸序列或与该序列具有至少70％、特别是80％、更特别是90％或更高同源性的氨基酸序列。N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)可以包括SEQIDNO：21的氨基酸序列或与该序列具有至少70％、特别是80％、更特别是90％或更高同源性的氨基酸序列。此外，在相应的酶的情况下，可以引入本领域中已知的修饰，以通过精氨酸释放反馈抑制。N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)可以包括SEQIDNO：23的氨基酸序列或与该序列具有至少70％、特别是80％、更特别是90％或更高同源性的氨基酸序列。乙酰鸟氨酸转氨酶(ArgD)可包括SEQIDNO：25的氨基酸序列或与该序列具有至少70％、特别是80％、更特别是90％或更高同源性的氨基酸序列。鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)可以包括SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的氨基酸序列，或者可以包括与SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。具体地，鸟氨酸氨基甲酰基转移酶(ArgF)可以包括与SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同源性的氨基酸序列。此外，显而易见的是，在一个或多个氨基酸残基中包括缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列落入本专利技术的范围内，只要它们与上述蛋白质具有同源性并且具有与上述蛋白质基本上相同或相应的生物活性即可。如本文所用，术语“同源性”是指用于比较的两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的相似性程度，并且它们的同源性可以通过裸眼或使用生物信息学算法的比较来确定，其通过比对要对比的序列来提供同源性程度的分析结果。两个氨基酸序列之间的同源性可以以百分比表示。有用的自动算法可以用于威斯康星州遗传学软件包(美国威斯康星州遗传学电脑集团，麦迪逊)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA计算机软件模块中。其它有用的算法和比对的同源性测定已经在软件中自动化，例如FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和CLUSTALW。在本专利技术中，精氨酸操纵子活性的增强可以指精氨酸操纵子中存在的酶中的至少一种酶的活性的增强，然而，其不包括单独的argR基因的单一增强。例如，精氨酸操纵子活性的增强可以指通过增强精氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种棒状杆菌属微生物，其具有以增强活性的精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶生产L‑精氨酸的能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.13 KR 10-2014-0137794;2015.05.29 KR 10-2011.一种棒状杆菌属微生物，其具有以增强活性的精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶生产L-精氨酸的能力。2.根据权利要求1所述的棒状杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴贤爱，李翰衡，姜旼暻，金宗贤，金蕙园，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR