三种山羊MC1R缺陷突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于山羊分子标记制备技术领域，具体涉及三个山羊MC1R缺陷突变体及其应用。本发明专利技术发现山羊MC1R受体存在三个缺陷突变体，其中导致受体缺陷的两个突变位点F250V和G255D都位于第六跨膜区上，另外一个导致受体缺陷的突变位点C267W位于第三膜外环上。这三个MC1R的缺陷突变体都丧失了对α‑MSH配体的亲和力，显著降低了诱导型和组成型cAMP水平，以及显著降低了诱导型和组成型p‑ERK水平。山羊MC1R缺陷突变体会导致真黑色素生成信号受阻，影响黑色被毛的形成。本发明专利技术的分子标记可应用于山羊毛色的标记辅助选择上。

Three goat MC1R deficient mutants and their applications

The invention belongs to the technical field of goat molecular marker preparation, in particular relating to three goat MC1R defect mutants and their application. The present invention found three defects of goat MC1R receptor mutant, which resulted in two mutation sites of F250V and G255D receptor defects are located in the sixth transmembrane region, another cause of receptor deficient mutation sites of C267W in the third film on the outer ring. These three MC1R mutants are lost to alpha MSH ligand affinity, significantly reduced the inducible and constitutive cAMP levels, and significantly reduced the inducible and constitutive levels of ERK P. Goat MC1R defect mutation leads to the fact that the melanin production signal is blocked and the formation of black coat is affected. The molecular marker of the present invention can be applied to marker assisted selection of goat wool color.

【技术实现步骤摘要】
三种山羊MC1R缺陷突变体及其应用
本专利技术属于山羊分子标记制备
，具体涉及三种山羊MC1R缺陷突变体及其应用。本专利技术的分子标记从编码山羊MC1R缺陷突变体的基因中得到。
技术介绍
毛色是认定畜禽品种的主要条件之一。被毛颜色取决于真黑色素和褐黑色素的比率。真黑色素增加，被毛呈现黑色；褐黑色素增加，被毛呈现黄或红色。两个基因座——Extension与Agouti基因座——调节着毛发或皮肤中的真黑色素和褐黑色素的量1。其中，Extension基因座编码黑皮质素受体1(melanocortin1receptor，MC1R)，它是仅存在于黑色素细胞中的黑皮质素受体(melanocortinreceptors，MCRs)，是G蛋白偶联受体的家族成员，具有7个跨膜区。对调控色素沉积具有关键作用2。MC1R受体的激活产生真黑色素，MC1R受体功能缺陷则产生褐黑色素。因此它是褐黑色素到真黑色素的开关。一般情况下，MC1R被促黑激素(melanocyte-stimulatinghormone，MSH)激活，产生第二信使cAMP并磷酸化细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)3,cAMP介导黑色素细胞分化和黑色素生成4，磷酸化激活的ERK则促进黑色素细胞的增殖5。Agouti基因座编码Agouti信号蛋白(Agoutisignallingprotein，ASIP)，这个旁分泌的信号小分子是MC1R的拮抗剂和抑制剂，能使MC1R受体功能失活。Extension基因座(MC1R)与Agouti基因座(ASIP)存在上位效应间的互作。MC1R对ASIP的上位效应表现为：出现MC1R的隐性纯合缺陷突变受体，产生红/黄/浅色被毛(只有褐黑色素的合成)；或出现高组成型活性突变受体，产生黑/深色被毛(真黑色素合成)。而ASIP对MC1R上位的前提是有野生型MC1R受体的存在。ASIP的上位效应表现为：过量拮抗剂/抑制剂的表达，产生红/黄/浅色被毛(褐黑色素合成比率提高)；或拮抗剂/抑制剂的表达缺失，产生黑/深色被毛(真黑色素合成)。MC1R基因富含多态，具有物种特异性。在多种哺乳动物中通过性状关联分析发现的MC1R高组成型活性突变位点就高达11个，包含小鼠中的S71L、E94K和L100P6、猪中的L99P、D121N和A240T7、绵羊中的M73K、D121N8,9、牛中的L99P10、马中的S83P、狐狸中的C125R、熊中的Y298C、狗中的R306X位点。其共同特点是能产生高组成型(基础水平)的cAMP信号。针对山羊MC1R基因，Wu等11在波尔山羊中发现了错译突变K226E。Fontanesi等利用6种不同毛色品种山羊发现了MC1R受体的5个自然突变体，包括A61A,A81V,F250V,Q255X和C267W12。Badaoui等13发现了在红色Palmera山羊排它性存在的G255D突变体。然而这些自然突变体对毛色性状的作用都是基于性状关联分析，其结果容易受到ASIP上位效应的影响。因此，本领域迫切需要对这些发现的自然突变体进行功能性鉴定，为毛色的标记辅助选择提供理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供三种功能确定的山羊MC1R突变体。本专利技术的另一目的是基于上述突变体，提供其作为分子标记的应用。申请人前期通过对麻城黑山羊和波尔山羊MC1R受体的变异分析，发现MC1R出现A61A、K226E、F250V、G255D、V265I和C267W共六个自然突变体；在群体中的连锁不平衡分析发现其中A61A与F250V呈连锁遗传，G255D与V265I呈连锁遗传。基于MC1R突变体对毛色性状的重要影响，构建了包含2个连锁遗传的8种突变载体，进行受体的功能鉴定。在本专利技术的第一方面，提供了三种功能确定的山羊MC1R突变体，它们都具有致MC1R受体缺陷的功能，并且所述的缺陷突变体选自下列序列：(a)SEQIDNO：1中第250位苯丙氨酸(F)被缬氨酸(V)替换的MC1R自然突变体；(b)SEQIDNO：1中第255位甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)替换的MC1R自然突变体；(c)SEQIDNO：1中第267位半胱氨酸(C)被色氨酸(W)替换的MC1R自然突变体；其中突变体(a)和(b)都位于第六跨膜区上，突变体(c)位于第三膜外环上。以上所述的突变体氨基酸序列选自：SEQIDNO：2、3或4。以上所述的突变体完全丧失了对α-MSH配体的亲和力(见图3)。以上所述的突变体显著降低了诱导型(见图4)和组成型cAMP水平(见图4、5)。以上所述的突变体显著降低了诱导型(见图6、8)和组成型p-ERK水平(见图6、7)。在本专利技术的另一方面，本专利技术提供了三个致MC1R受体缺陷的遗传标记在山羊毛色分子标记辅助选择中的应用。在本专利技术的另一方面，本专利技术提供了三个致MC1R受体缺陷的遗传标记，它们都位于序列表SEQIDNO：5的954碱基位的序列内，其包括：(a)SEQIDNO：5中第748bp处T碱基突变为G；(b)SEQIDNO：5中第764bp处G碱基突变为A；(c)SEQIDNO：5中第801bp处C碱基突变为G。在本专利技术的另一方面，申请人制备了检测上述缺陷突变位点的引物对，该引物对的序列如下所示：正向引物：ATGCCTGCACTCGGCTCCC，(见序列表SEQIDNO：6)反向引物：TCACCAGGAGCACTGCAGCACC。(见序列表SEQIDNO：7)最后，申请人提供了一种上述遗传标记的筛选方法，该方法包括以下步骤：提取样本山羊血液总DNA，根据山羊MC1R基因组DNA序列信息设计引物对，该引物对的序列如序列表SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示，用序列表SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示的引物对在山羊基因组DNA样本中进行PCR扩增，PCR产物直接测序，获得如序列表SEQIDNO：5和图1所示的测序峰图，以此判断是否存在上述的分子标记。归纳起来，本专利技术的技术方案如下所述：一种山羊MC1R缺陷突变体F250V，该突变体的氨基酸序列如下所示：MPALGSPRRLLGSLNCTPPATLPLTLAPNRTGPQCLEVSIPDGLFLSLGLVSLVENVLVVAAIAKNRNLHSPMYYFICCLAMSDLLVSVSNVLETAVMLLLEAGVLATRAAVVQQLDNVIDVLICSSMVSSLCFLGAIAVDRYISIFYALRYHSVVTLPRAWRIIAAIWVASILTSVLSITYYNHTVVLLCLVGFFIAMLALMAVLYVHMLARACQHARGIARLQKRQRPIHQGFGLKGAATLTILLGVX(F/V)FLCWGPFFLHLSLIVLCPQHPTCGCIFKNFNLFLALIICNAIVDPLIYAFRSQELRKTLQEVLQCSW上述序列的第250位的X是突变氨基酸，其中的苯丙氨酸(F)被缬氨酸(V)替换。一种山羊MC1R缺陷突变体G255D，该突变体的氨基酸序列如下所示：MPALGSPRRLLGSLNCTPPATLPLTLAPNRTGPQCLEVSIPDGLFLSLGLVSLVENVLVVAAIAKNRNL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山羊MC1R缺陷突变体F250V，其特征在于：该突变体的氨基酸序列如下所示：MPALGSPRRLLGSLNCTPPATLPLTLAPNRTGPQCLEVSIPDGLFLSLGLVSLVENVLVVAAIAKNRNLHSPMYYFICCLAMSDLLVSVSNVLETAVMLLLEAGVLATRAAVVQQLDNVIDVLICSSMVSSLCFLGAIAVDRYISIFYALRYHSVVTLPRAWRIIAAIWVASILTSVLSITYYNHTVVLLCLVGFFIAMLALMAVLYVHMLARACQHARGIARLQKRQRPIHQGFGLKGAATLTILLGVX FLCWGPFFLHLSLIVLCPQHPTCGCIFKNFNLFLALIICNAIVDPLIYAFRSQELRKTLQEVLQCSW上述序列的第250位的X是突变氨基酸，其中的苯丙氨酸(F)被缬氨酸(V)替换。

【技术特征摘要】
1.一种山羊MC1R缺陷突变体F250V，其特征在于：该突变体的氨基酸序列如下所示：MPALGSPRRLLGSLNCTPPATLPLTLAPNRTGPQCLEVSIPDGLFLSLGLVSLVENVLVVAAIAKNRNLHSPMYYFICCLAMSDLLVSVSNVLETAVMLLLEAGVLATRAAVVQQLDNVIDVLICSSMVSSLCFLGAIAVDRYISIFYALRYHSVVTLPRAWRIIAAIWVASILTSVLSITYYNHTVVLLCLVGFFIAMLALMAVLYVHMLARACQHARGIARLQKRQRPIHQGFGLKGAATLTILLGVXFLCWGPFFLHLSLIVLCPQHPTCGCIFKNFNLFLALIICNAIVDPLIYAFRSQELRKTLQEVLQCSW上述序列的第250位的X是突变氨基酸，其中的苯丙氨酸(F)被缬氨酸(V)替换。2.一种山羊MC1R缺陷突变体G255D，其特征在于：该突变体的氨基酸序列如下所示：MPALGSPRRLLGSLNCTPPATLPLTLAPNRTGPQCLEVSIPDGLFLSLGLVSLVENVLVVAAIAKNRNLHSPMYYFICCLAMSDLLVSVSNVLETAVMLLLEAGVLATRAAVVQQLDNVIDVLICSSMVSSLCFLGAIAVDRYISIFYALRYHSVVTLPRAWRIIAAIWVASILTSVLSITYYNHTVVLLCLVGFFIAMLALMAVLYVHMLARACQHARGIARLQKRQRPIHQGFGLKGAATLTILLGVFFLCWXPFFLHLSLIVLCPQHPTCGCIFKNFNLFLALIICNAIVDPLIYAFRSQELRKTLQEVLQCSW上述序列的第255位的X是突变氨基酸，其中的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)替换。3.一种山羊MC1R缺陷突变体C267W，其特征在于：该突变体的氨基酸序列如下所示：MPALGSPRRLLGSLNCTPPATLPLTLAPNRTGPQCLEVSIPDGLFLSLGLVSLVENVLVVAAIAKNRNLHSPMYYFICCLAMSDLLVSVSNVLETAVMLLLEAGVLATRAAVVQQLDNVIDVLICSSMVSSLCFLGAIAVDRYISIFYALRYHSVVTLPRAWRIIAAIWVASILTSVLSITYYNHTVVLLCLVGFFIAMLALMAVLYVHMLARACQHARGIARLQKRQRPIHQGFGLKGAATLTILLGVFFLCWGPFFLHLSLIVLXPQHPTCGCIFKNFNLFLALIICNAIVDPLIYAFRSQELRKTLQEVLQCSW上述序列的第267位的X是突变氨基酸，其中的半胱氨酸(C)被色氨酸(W)替换。4.一种山羊MC1R缺陷突变体F250V的分子标记在山羊毛色标记辅助选择中的应用，其特征在于：该分子标记的核苷酸序列如下所示：ATGCCTGCACTCGGCTCCCCGAGGCGGCTGCTGGGTTCCCTTAACTGCACACCCCCAGCCACCCTCCCCCTCACACTGGCCCCCAATCGGACAGGGCCCCAGTGCCTGGAGGTGTCCATCCCTGACGGGCTCTTTCTCAGCCTGGGGCTGGTGAGTCTTGTGGAGAACGTGCTGGTGGTGGCCGCCATCGCCAAGAACCGCAACCTGCACTCCCCCATGTACTACTTCATCTGCTGCCTGGCCATGTCCGACCTGCTGGTGAGCGTCAGCAACGTGCTGGAGACGGCAGTCATGCTGCTGCTGGAGGCTGGTGTCCTGGCCACCCGGGCGGCCGTGGTACAGCAGCTGGACAATGTCATTGACGTGCTCATCTGCAGCTCCATGGTGTCCAGCCTCTGCTTCCTGGGTGCCATCGCTGTGGACCGCTACATCTCCATCTTCTACGCCCTGCGGTACCACAGTGTCGTGACACTGCCCCGCGCGTGGAGGATCATTGCAGCCATCTGGGTGGCCAGCATCCTCACCAGCGTGCTCTCCATCACCTACTACAACCACACGGTCGTCCTGCTGTGCCTCGTTGGCTTCTTCATAGCCATGCTGGCCCTGATGGCCGTCCTCTATGTCCACATGCTGGCCCGGGCCTGCCAGCATGCCCGGGGCATCGCCCGGCTCCAGAAGAGGCAGCGCCCCATTCATCAGGGCTTTGGCCTCAAGGGCGCTGCCACCCTCACCATCCTGCTGGGCGTCRTCTTCCTCTGCTGGGGCCCCTTCTTTCTGCACCTCTCGCTCATCGTCCTCTGCCCCCAGCACCCCACCTGTGGCTGCATCTTCAAGAACTTCAACCTCTTCCTGGCCCTCATCATTTGCAACGCCATTGTGGACCCCCTCATCTATGCCTTCCGCAGCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊琪，陈明新，李晓锋，索效军，张年，杨前平，陶虎，刘洋，田宏，张鹤山，熊军波，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42