The invention discloses a preparation method of liraglutide, mainly used to solve the problems of existing technology of heavy metal catalysts and the synthesis steps of complex and difficult purification technical defects. The technical scheme of the invention comprises the following steps: 1) to Fmoc Gly Wang Shuzhi as the carrier, using Fmoc solid phase synthesis method by coupling second to twelfth amino acid polypeptide, obtained resin I; 2) acid solution of MMT based protection removal eleventh Lys side chain, and modified Pal gamma Glu in resin. Then hydrazinolysis removal of Dde protective group peptidemaintained resin II; 3) to thirteenth coupling to thirty-first amino acid polypeptide, obtained III resin, 4) polypeptide resin into the III line cutting, the peptide from the resin cracking down and removing the side chain protecting groups are liraglutide crude, followed by high performance liquid chromatography purified and freeze-dried to obtain liraglutide. The preparation process of liraglutide method provided by the invention has the characteristics of simple operation, high purity and yield of crude peptide synthesis high.
【技术实现步骤摘要】
一种利拉鲁肽的固相合成法
本专利技术涉及多肽固相合成领域，尤其涉及利拉鲁肽的固相合成方法。
技术介绍
利拉鲁肽，英文名称为liraglutide，分子式:C172H265N43O51，分子量：3751.20，CAS号:204656-20-2。其肽序为：NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH。利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司研制，是胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的受体激动剂，作为一种皮下注射制剂，能起到良好的降低血糖作用。利拉鲁肽与天然GLP-1分子结构相比有一个氨基酸差异，并增加了一个16碳棕榈酰脂肪酸侧链，与天然人GLP-1有95%同源性。并且由于脂肪酸侧链的存在，其分子不易被DPP-IV降解，并能与白蛋白结合因而有较高的代谢稳定性。利拉鲁肽的活性由其与GLP-1受体间特定的相互作用介导，导致环磷酸腺苷（cAMP）的增加。...
【技术保护点】
一种利拉鲁肽的固相合成法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以Fmoc‑Gly‑王树脂为载体，采用Fmoc固相合成法逐一偶联第2位至第12位氨基酸，得到多肽树脂I： Dde‑Lys(mmt)‑Glu(Otbu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑王树脂（I）；（2）酸解去除第11位Lys侧链的mmt保护基，并在树脂上修饰Pal‑γ‑Glu，再肼解去除Dde保护基，得到多肽树脂II：NH2‑Lys(γ‑Glu‑Pal)‑Glu(Otbu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg...
【技术特征摘要】
1.一种利拉鲁肽的固相合成法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以Fmoc-Gly-王树脂为载体，采用Fmoc固相合成法逐一偶联第2位至第12位氨基酸，得到多肽树脂I：Dde-Lys(mmt)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（I）；（2）酸解去除第11位Lys侧链的mmt保护基，并在树脂上修饰Pal-γ-Glu，再肼解去除Dde保护基，得到多肽树脂II：NH2-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（II）；（3）继续偶联第13位至第31位氨基酸，其中第20，21位氨基酸和第24，25位残基分别用假二肽片段X,Y所取代，得到多肽树脂III：His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Y-Asp(Otbu)-Val-X-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（III）X=Ser(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)；Y=Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)；（4）加入裂解试剂对多肽树脂III进行裂解，将三十一肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，同时打开序列中两个个假二肽片段X,Y的五元环，得到利拉鲁肽粗品，利拉鲁肽粗品再经高效液相色谱分离纯化、冻干精制得到利拉鲁肽：NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）具体内容包括如下步骤取Fmoc-Gly-王树脂用DMF浸泡，使Fmoc-Gly-王树脂充分溶胀，抽干，加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH,NMM,选择HBTU/HOBT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-王树脂；然后再加入脱帽试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完第12位的赖氨酸,得到多肽树脂I：Dde-Lys(mmt)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂,所说的保护氨基酸依次包括Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Dde-Lys(mmt)-OH。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Fmoc-Gly-王树脂的取代度在0.3mmol/g-0.5mmol/g之间，脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，Fmoc-Arg(Pbf)-OH的量为Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的2倍，每一步保护氨基酸的量的是Arg(Pbf)-Gly-王树脂摩尔量的2倍，HBTU/HOBT的量是Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的2倍，NMM的量是Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的4倍，每一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）具体内容包括如下步骤在步骤（1）获得的多肽树脂I中，加入酸解试剂，反应30分钟，抽干，重复两次，用DMF洗涤10次，抽干；加入Fmoc-Glu-Otbu,NMM,选择HATU/HOAT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐红岩，竺剑峰，
申请(专利权)人：吉尔生化上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。